среда, 18 июня 2014 г.

Общий обзор создания Нокаут, Нокдаун, Tрансгенныx и Условный нокаут (Cre-Lox system) мышей.

Pисунок1
Давно хотел написать это сообщение, т.к. когда пишу свой посты в блоге постоянно говорю: "Х ген дефицитные мыши, или мыши у которых отсутствует Х ген показали высокий уровень .... чем контрольные животные", в плане постоянно приходится увёртываться т.к. я не уверен что все кто читает мой блог знают например разницу между нокаут и нокдаун мышами.
Поэтому решил всё описать в одном сообщении чтобы в дальнейшем делать ссылку на этот пост.

Если очень коротко и поверхностно, то
Нокаут-это когда Х ген отсутствует в принципе, поэтому нет и РНК кодирующий этот ген и соответственно протеина.
Нокдаун-это когда Х ген присутствует в клетке или животном, и даже РНК синтезируется но дальше дело не идёт, т.к. РНК в данном случае разрушается и соответственно до протеина дело не доходит.
Трансгенные мыши-это те мыши которым внедрили Х ген, например в мышку можно "легко" заставить экспрессировать любой человеческий ген и смотреть какую функцию он играет в физиологических или патофизиологических процессах.
Условный нокаут-это самое последнее слово техники. В этом случае нокаут гена происходит при определённых условиях или только в определённых видах клеток. Например, многие нокаут мыши эмбрионально летальные что делает не возможным исследования этих мышей во взрослом периоде. И условный нокаут решает эту проблему тем что Х ген нокаутируется только при определённых условиях (при кормлении определёнными препаратами).

Если люди особо не интересуются "hard core" биологией, то это знания минимум которые помогут вам разобраться что к чему...:).

Я в основном буду фокусироваться на нокаут и условный нокаут моделях.
Развитие нокаут мышей (и в целом технологии) получило своё признание в 2007 году когда три исследователя Mario Capecchi, Oliver Smithies и Martin Evans получили Нобелевскую премию по Медицине за свои работы в области развития нокаут животных.
В целом в основе нокаут мышей лежат два фундаментальных открытия в области биологии и генетики это выделение и охарактеризование мышиных эмбриональных стволовых клеток и гомологичная рекомбинация.
Со стволовыми клетками, я думаю особо объяснять не надо, это клетки которые обладают способностью самообновляться и дифференцироваться в любую ткань. 
Гомологичная рекомбинация это также давно известный процесс обмена идентичными последовательностями нуклеотидов между двумя молекулами ДНК.
Так вот умные люди взяли и объединили эти два открытия для того чтобы создавать животных у которых будет отсутствовать любая часть генома, и тем самым изучать эту часть генома как loss of function.
Схематически всё очень просто (далеко не очень просто на практике, но я не буду говорить о трудностях выведения нокаут мышей, просто скажу что на получение таких мышей если тебе повезёт, в лучшем случае уходит 1 год интенсивной работы).

Всё начинается с того что, вы конструируете плазмиду (вектор) в которой по флангам будут последовательности гомологичные последовательности ДНК хозяина, а в центре будут располагаться те экзоны или экзон (или любая последовательность которая вам интересна) которые вы хотите удалить (Pисунок 2). Доставляете (трансфектируете) свою плазмиду в эмбриональную стволовую клетку, чаще всего исследователи используют электропорацию. И благодаря гомологичной рекомбинации плазмида должна интегрироваться именно там где вы хотите удалить желаемую последовательность. Обычно вместо желаемого экзона в плазмиду вставляют антибиотик резистентный ген, в большинстве случаев это Неомицин резистентный ген "neo r" (рисунок 2). Так как уровень трансфекции очень низкий благодаря лечению G418 (аналог неомицина, но в отличие от неомицина токсичен для клеток млекопитающих), вы сможете селектировать трансфектированные клетки (которые будут нести антибиотик резистентный ген) от не трансфектированных, трансфектированные выживут т.к. несут neo r ген а не трансфектированные умрут. выжившие клетки будут создавать колонии, вы собираете и подтверждаете на ПЦР что трансфекция есть. Далее вводите эти стволовые клетки в бластоцисту мышки и в итоге рождается химерная мышь (некоторые клетки будут нокаут, а некоторые нет). Вы скрещиваете эти химерные мыши между собой несколько раз и в итоге получаете чистую колонию нокаут мышей....:).
Pисунок 2


Условный нокаут происходит примерно по той же схеме, только в добавок к этому методу используют Cre-Lox систему. Пример: на рисунке 3 когда вы конструируете свою плазмиду вы вставляете маленькие последовательности 34bp LoxP перед желаемым экзоном, после и после neo r гена (обозначены как треугольники). Трансфектируете, делаете антибиотик селекцию и потом трансфектируете вектор несущий  Cre рекомбиназу. Cre  рекомбиназа узнаёт LoxP последовательности и разрежит вам вашу встроенную плазмиду в трёх вариантах, вам нужен 3-й вариант где желаемый экзон будет флангираваться LoxP последовательностями. Благодоря ПЦР подтверждаете желаемую последовательность и инъектируете эти стволовые клетки в бластоцисту. После того как вы получили чистую колонию скрещиваем её с мышами несущие ген Cre рекомбиназы. Отпрыски будут нести две плазмиды в своём геноме это LoxP-ген-LoxP и Cre. Cre рекомбиназа будет резать LoxP последовательности и тем самым удалять нужный вам ген (рисунок 3 и 4).


Pисунок 3
Если вы ходите чтобы ваш нокаут происходил только в определённом типе клеток (нервные, эпителиальные, иммунные итд клетки) то в Cre плазмиду надо вставить промоутерную часть того гена который экспрессируется только в определённом виде клеток. Например, я хочу нокаутировать свой Х ген в скелетных мышцах и нигде более. Для этого надо вставить промоутерную часть гена кодирующий тяжёлую цепь миозина в Cre плазмиду и Cre будет экспрессироваться только в мышцах, и тем самым  удалять Х ген исключительно в мышцах.

Pисунок4
Если мы хотим нокаутировать Х ген во всём организме но только во время эксперимента. То в таком случае, надо создавать слившуюся Cre рекомбиназу с протеином такой как мутированный гормон-связывающий домен эстрогенного рецептора (рисунок 4). В таком случае ваша рекомбиназа будет сливаться с этим доменом и будет оставаться неактивной до тех пор, пока вы не начнёте лечить мышей тамоксифеном, который будет связываться с этим доменом и тем самым Cre будет в активной форме. Тамоксифен зависимая Cre рекомбиназа является одной из самых первых, сейчас также существуют тетрациклин и доксициклин зависимые Cre рекомбиназы.

Техника нокдаун использует совсем другие принципы и механизмы. Не буду писать все детали, но всё сводится к тому что в наших клетках молекула РНК однаспиральная,  двухспиральная РНК существует у вирусов и других патогенов. Тем самым когда в клетке появляется двухспиральный РНК, клетка запускает механизмы деградации этой РНК (защитная реакция). Исследователи используют этот механизм в своих целях. Можно экспрессировать маленький участок РНК (20-30 bp) который будет комплементарен с мРНК, в итоге будет образовываться маленький участок двухспиральной РНК, который и запустит механизм деградации желаемого РНК и соответственно протеин не будет синтезироваться. А всё остальное селекция, инъекция в бластоцисту, химерные мыши всё также.

Написал много, но теперь в будущих постах буду прямо писать нокаут мыши....:).

Литература:
Methods Mol Biol. 2009;530:343-63.
Curr Protoc Cell Biol. 2009 Sep;Chapter 19:Unit 19.12 19.12.1-17.


2 комментария:

  1. А с какой целью используют нокдаун? Или просто утилитарнее?

    ОтветитьУдалить
    Ответы
    1. мне конечно надо проверить но на сколько я помню нокдаун лучше тем что быстрее сам процесс выведения таких мышей т.к. shRNA вставляешь в ленти-вирусный вектор. И потом ленти-вирусные частицы добавляешь в медию и всё, если сравнивать обычную трансфекцию и ленти-вирусную то ленти-вирусная намного эффективнее. В целом, нокдаун изначально использовался исключительно в in vitro экспериментах, и только недавно стали выводить нокдаун мышей. но опять таки есть минусы у таких мышей т.к. я очень очень редко видел когда shRNA ингибировал на 100% экспрессию гена, обычно в лучшем случае 70-80% иногда 90%.

      Удалить