пятница, 28 ноября 2014 г.

Толерантность как альтернативный, защитный механизм.

Классически принято считать что защитные механизмы хозяина против инфекции (в этом тексте хозяин будет подразумевать животное и/или человека) традиционно считаются иммунными, которые нацелены на опознавание и уничтожение внедрившихся патогенов. Но если брать другие организмы такие как растения то уже на протяжении многих лет известно что некоторые растения имеют способность "терпеть" в своём организме патогены, не уничтожая их с одной стороны и продолжая свою жизнедеятельность с другой стороны. Тем самым утверждая что в мире живых существ в ходе эволюционного развития существуют различные механизмы и стратегии которые нацелены на защиту хозяина от инфекционных заболеваний. Все эти тактики можно разделить на 3 группы:
1) Уклонение - это стратегия нацеленная на изменение поведения хозяина таким образом чтобы минимизировать контакт с патогеном и тем самым не быть инфицированным. Обычно этот вид защиты использует органы обоняния и вкусовые рецепторы. Возьмём классический пример, испорченная еда, это результат жизнедеятельности различных микробов которые вредны для нашего организма. Системы обоняния и вкуса распознают плохой продукт, благодаря соответственно плохому запаху и вкусу продукта, вы уклоняетесь его потреблять чтобы не заболеть.
2) Резистентность - это стратегия которая нацелена на уничтожение внедрившегося патогена. Резистентность это функция иммунной системы, которая детектирует, нейтрализует и уничтожает или выводит (как в случае с гельминтами) патогены из хозяина. Клетки врождённого и приобретённого иммунитета несут свой вклад на способность организма к резистентности патогена. Резистентность (в данном случае иммунорезистентность) часто идёт параллельно повреждению родной ткани. Так например, микробы индуцируют нейтрофилы высвобождать миелопероксидазу которая обладает хорошим бактерицидным действием но в тоже время миелопероксидаза это сильный окислитель который может убить не только бактерию но и родную клетку что при высокой концентрации приводит к иммунопатологии. И здесь идёт постоянный трейдинг в плане "результат оправдывает средства или нет?".
3) Толерантность - это стратегия при которой хозяин использует механизмы нацеленные на защиту своих органов жизнедеятельности и/или тканей от патологического воздействия инфекции но при этом не влияя на уровень патогенов в организме. Стоит различать толерантность к болезни и иммунотолерантность, толерантность к инфекционной болезни подразумевает приспособление клеток ткани к токсинам и другим вирулентным факторам которые экспрессируются непосредственно патогеном, когда как иммунотолерантность нацелена на нейтрализацию негативного эффекта иммунной системы в ответ на присутствие патогена или чужеродного антигенa.

Я думаю что первые две стратегии более или менее понятны для большинства читателей. Они известны достаточно долго и достаточно хорошо изучены. В целом, иммунология животных и человека в контексте изучения взаимоотношении хозяина с патогенами исследует механизмы резистентности.
Но толерантность к инфекционным заболеваниям относительно новое понятие по отношению к животным.
Впервые свидетельства толерантности хозяина к патогенам были найдены у растений в середине 20 века. В дальнейшем толерантность как альтернативная стратегия защиты была расширена на другие формы жизни. Так например, при изучении генома дрозофил были обнаружены гены при мутации которых значительно изменяется выживаемость мутированных мух но в тоже время эти мутации не влияли на уровень патогена в мухах, к таким генам относились гены кодирующие цитокины или гены контролирующие метаболизм в клетках.
В 2007 году было проведено первое в истории исследование изучающее толерантность у млекопитающих (мышы). Различные линии (strain) мышей инфицировали плазмодиями (Plasmodium chabaudi) которые вызывают малярию в различных дозах и наблюдали за такими параметрами патогенности паразита как анемия (количество эритроцитов) и вес животных. Результаты исследования ясно показали что различные  линии (что по умолчанию означает различные генотипы) мышей теряют эритроциты или вес во время инфекции по разному и у некоторых увеличение уровня патогена не пропорционально понижению эритроцитов, говоря что некоторые линии более толерантны чем другие.
Пример, если посмотреть на рисунок, то из него следует что у обоих хозяинов (линия) с увеличением уровня патогена уровень здоровья понижается, но хозяин (А) более толерантен к данному патогену чем (B) так как при увеличении уровня патогена  у (А) понижение здоровья происходит медленнее чем у (B).

 Механизмы....: В том же 2007 году, сами того не подозревая вышла в свет работа которая описывала вовлечение определённого гена в толерантность к малярийному паразиту. Это был Гем Оксигеназа-1 (heme oxygenase-1, HO-1) функция этого гена является, разрушение молекулы гема на ионы железа, биливердин и окись углерода (угарный газ) (детальное описание функции HO-1 http://naukageek.blogspot.com/2014/07/blog-post_17.html). При "активной" фазе малярийного плазмодия, он разрушает эритроциты и тем самым высвобождает гем, так как гем сам по себе очень токсичный то это приводит к повреждению тканей. Но в организме существуют механизмы его утилизации включая HO-1 ген. Исследователи показали что при экспрессии HO-1 выживаемость животных улучшается но при этом уровень плазмодий не понижается.

В целом сейчас механизмы толерантности активно изучаются так как именно в механизмах можно будет найти молекулу или ген который станет отправной точкой для фармакологов и фармацевтов чтобы синтезировать новые лекарства.
В заключение хотел бы сказать что те люди которые непосредственно занимаются иммунологией и/или инфекционными заболеваниями могут по достоинству оценить данное открытие. Ведь это открывает не только и не просто какой-то новый молекулярный механизм это открывает новый раздел в иммунологии и медицине в целом.

Литература:
Trends Immunol. 2014 Oct;35(10):483-94.
Science. 2012 Feb 24;335(6071):936-41.
Science. 2007 Nov 2;318(5851):812-4.
Nat Med. 2007 Jun;13(6):703-10.




пятница, 21 ноября 2014 г.

Мезенхимальные Стволовые (Стромальные) Клетки, в поисках магической пули.....


Клеточная терапия вот что появляется (а вернее уже появилось) на горизонте биологических исследований. Раньше этаким светом в конце туннеля был ген и соответственно генная терапия, но после первых неудачных клинических испытаний горькое послевкусие сохранилось до сих пор.  А ведь 10-15 лет назад "здание" науки сотрясалось от восторгов и дифирамбов поющие его величеству ГЕН, вот это ядро всего живого, всех болезней и всего чего хочешь....но потом восторг сменился на успокоение, задумчивость и в итоге сейчас достаточно сильно поутих, но стоит сказать что определённые успехи в клинике были достигнуты (что было описано, в прошлом сообщении http://naukageek.blogspot.com/2014/04/blog-post_24.html). И вот настал черед другого события, клеточная терапия, люди начали употреблять данный термин с открытием и выделением эмбриональных стволовых клеток (ESC), где в лабораторных условиях можно было дифференцировать эти клетки в любую ткань человека, огромный ресурс таится в этих клетках как и огромные возможности их применения. И через некоторое время произошёл ещё один виток это открытие индуцированных плюропотентных стволовых клеток (iPS cells). Не надо повреждать эмбрион, но можно индуцировать стволовитость в обычных соматических клетках (например фибробласты) путём экспрессии нескольких генов (может быть без генной терапии мы и проживём но без генной инженерии никуда). Сейчас это всё дело изучают, проверяют, испытывают и говоря о прогрессе в этой области, стоит сказать что в сентябре-октябре этого года началось первое клиническое испытание iPS cells при макулярной дегенерации сетчатки, куда это нас всех заведёт покажет лишь время.

Мезенхимальные стволовые/стромальные клетки (МСК).
Смотря на все эти события иммунологи стоят как-то в стороне...ну и действительно ведь в теории дифференцированная ткань из стволовых клеток для чего? для того чтобы заменить повреждённую родную, наверное те кто занимается вопросами трансплантации, ишемических болезней, травм будет заинтересован в первую очередь. Но с другой стороны говорить о полной непричастности иммунологов к стволовым клеткам тоже неправильно, ведь исследования в области кроветворных стволовых клеток сделало большой вклад в современное понимание и методы исследования  стволовых клеток и первые кто этим занимались были гематологи, иммунологи и онкологи.
И тогда-то в 1974 году в небольшом журнале Transplantation была опубликована работа Friedenstein AJ и его коллег, где было впервые описаны мезенхимальные стволовые/стромальные клетки (МСК), тогда конечно они так не назывались, он их назвал как CFU-F-derived stromal cells (CFU-F - colony forming unit-fibroblast). CFU это экспериментальный показатель способности клетки воспроизводить себе подобную, создавать колонию, в наши дни одно из важнейших качеств стволовых клеток "self-renewal" определяется именно этим методом. Так вот этот учёный "вываливая" содержимое костного мозга в culture dish, заметил что после некоторого времени, клетки образуют фибробластные колонии, он выделил эти клетки и охарактеризовал их как клетки которые служат помощниками кроветворным стволовым клеткам, создавая для последних нишу для существования и доставляя питательные вещества.
Первое изображение МСК док.Фриденштейном
                 Transplantation 17, 331–340 (1974)

В дальнейшем МСК начали обнаруживать не только в костном мозге но и в других тканях такие как жировая ткань, лёгкие, печень, кровеносные сосуды другими словами практически везде. И для того чтобы держать "строй" и не путать МСК с другими видами клеток например фибробластами, группа исследователей вывела минимальные критерии которыми должны обладать МСК. 1) МСК должны быть plastic adherent, при культивировании их в culture dish они должны прилипать ко дну. 2) МСК должны экспрессировать ряд маркеров на своей клеточной мембране это  CD105, CD73 и CD90 и не экспрессировать CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79alpha или CD19 и HLA-DR что преимущественно гематопоэтические маркеры. И 3) МСК должны иметь способность дифференцироваться в как минимум 3 вида ткани это хрящевая, костная и жировая ткань.  Состав маркеров CD может меняться в зависимости от вида.

МСК и иммунитет.
И лишь спустя 28 лет, в 2002 году две научные группы независимо друг от друга идентифицировали что МСК могут ингибировать пролиферацию Т-лимфоцитов. В 2008 году, Катерина Ле Бланк со своими коллегами показали что МСК обладают терапевтическими свойствами при болезни трансплантат против хозяина, понижая реактивность Т-клеток донора на клетки реципиента и тем самым значительно улучшая выживаемость. И также было задокументировано что МСК действуют независимо от HLA донора, обусловлено это тем что МСК не экспрессируют MHC II class и на низком уровне MHC I class что делает их "иммунопривилегированными" клетками, чуть ли не идеальным кандидатом в области клеточной терапии. Эти статьи и результаты стали толчком для исследования МСК как иммунорегуляторные клетки и их потенциальное использование в иммунных расстройствах.
В 2009 году Nemeth K со своими коллегами опубликовали работу где впервые показали терапевтический эффект МСК при экспериментальной модели сепсиса. Эта работа также указывала на иммунорегуляторные способности МСК благодаря взаимодействию с моноцитами и макрофагами. В 2013 году, другая лаборатория показала что МСК также могут "общаться" с нейтрофилами и стимулировать их поедать бактерии, также было задокументировано влияние МСК на хемотаксис, релиз антимикробных пептидов и выживаемость нейтрофилов что также может иметь большое влияние выживаемость во время сепсиса.

Схематическое изображение многофункциональности МСК.

На счёт механизма действия то это сейчас является исследовательской темой многих лабораторий. Все механизмы можно условно разделить на два типа это прямой контакт МСК с иммунной клеткой и паракриновый эффект. Механизм прямого контакта в целом очень слабо изучен, лишь недавно была опубликована интересная работа которая утверждает что МСК производит перенос своих митохондрий в повреждённую клетку что в свою очередь восстанавливает энергетический баланс и не даёт повреждённой клетке умереть или есть свидетельства что к примеру МСК экспрессирует лиганды которые при прямом контакте соприкасаются и активизируют рецепторы на иммунных клетках что приводит к их активизации или наоборот инактивизации. Но мне если честно кажется что прямой контакт имеет маленькое влияние (если вообще имеет) на тот эффект который может иметь инъекция МСК в животных. Например, на мышиной модели сепсиса, исследователи вводят около 1 миллиона МСК, и эти 1 миллион улучшают выживаемость значительно, и представьте со сколькими иммунными клетками сможет контактировать этот 1 миллион....так что я больше склоняюсь к версии что МСК экспрессирует во внеклеточное пространство ряд активных медиаторов которые несут тот эффект которыми обладают МСК. И ещё одно, при различных моделях, включая сепсис, не обязательно вводить клетки, медия в которой культивировались МСК полностью подражает эффект самих клеток, что опять указывает на паракриновую составляющую.
В эти дни по всему миру насчитано более 344 клинических испытаний где используются МСК в качестве терапии при различных заболеваниях включая и иммунные расстройства такие как трансплантат против хозяина, системная красная волчанка, рассеянный склероз, болезнь Крона, острый респираторный дистресс-синдром.

P.S. Изначально МСК назывались мезенхимиальными стволовыми клетками, но в дальнейшем "стволовое" научное сообщество резко раскритиковало такое название утверждая что МСК не стволовые т.к. могут дифференцировать только в клетки мезодермального происхождения, существуют единичные статьи где исследователи смогли дифференцировать МСК в клетки других слоёв, но широкого применения эти исследования не получили из-за не идеальной воспроизводимостью экспериментов. Поэтому в дальнейшем название поменяли на мезенхимиальные стромальные клетки, в целом тоже не плохо т.к. когда вбиваешь в поисковик МСК (MSC) то что stem что stromal начинается на S.

Литература:
Transplantation 17, 331–340 (1974)
Exp Hematol. 2002 Jan;30(1):42-8.
Blood. 2002 May 15;99(10):3838-43.
Lancet. 2008 May 10;371(9624):1579-86.
Nat Med. 2009 Jan;15(1):42-9.







четверг, 13 ноября 2014 г.

СЕПСИС, от иммуновоспаления до иммуносупрессии.

Изначально, в целом как и в эти дни, сепсис считается систематической  воспалительной  реакцией  организма на присутствие инфекции.
Инфекция-Воспаление-Сепсис это как-бы последовательность событий, которые идут и которые приводят к "состоянию", можно конечно приписать multiple organ failure, septic shock and death, но для упрощения будут только 3 звена.
Из всех клинических случаев где пишется в графе диагноз "Сепсис", в 1/3 случаев источник воспаления не определён. Бывает даже такое, человек поступает в ICU (intensive care unit, неотложка), диагностируют сепсис, лечат как положено антибиотиками, уничтожают инфекцию, пациенту вроде как становится легче а через пару дней кома и смерть. Так что загадок много.

Но давайте вернёмся к нашей догме, Инфекция-Воспаление-Сепсис. В каких точках мы можем "tackle" эту проблему? Ответ прост, во всех трёх. Инфекция-антибиотики, Воспаление-противовоспалительные препараты в теории, Сепсис (как клиническое состояние) - аппаратами которые поддерживают или заменяют функцию жизненно важных органов (лёгкие, почки), вазосупрессоры (сосудо-сужающие) препараты.
Инфекция-антибиотики, на мой взгляд это как гонка вооружения, пенициллин через некоторое время пенициллин резистентная бактерия и так по нарастающей, сейчас уже антибиотики 3,4,5 поколения...а бактерии эволюционируют и приспосабливаются.
С аппаратами которые поддерживают функцию органов тоже больших изменений нет, есть конечно какие-то улучшения в плане сенситивности, точности но чтобы что-то поистине инновационное, такого нет.

Воспаление 
И наверное само сильно-дискутируемое звено в этой цепи это воспаление, начиная с того воспаление это хорошо или плохо? реально учёные, клиницисты не могут точно сказать. Кто-то ЗА хорошо, а кто-то ЗА плохо. И эти дискуссии начались относительно недавно, может лет так 5-7 назад. В начале 90-х воспаление не подвергалось сомнению, воспаление это плохо, воспаление в большей части за счет активизированных иммунных клеток, которые своей гиперактивацией не только убивают патоген но и повреждают "родную" ткань что и в итоге приводит к иммунопатологии. Главные моторы воспаления это цитокины выделяемые иммунными  клетками, при сепсисе они действительно завышены в крови. Особенно в больших количествах выделяются цитокины группы фактор некроза опухоли, tumor necrosis factor, TNF (в частности TNF-alpha) и интерлейкины, interleukins  (в частности IL-1beta). Как говорится главные "враги" были обнаружены, и теперь дело вроде бы как за малым, надо их всего лишь нейтрализовать.  И вродебы всё логично, если антибиотики делают свою работу, то воспалительная реакция (как защитная) просто напросто не нужна, не скем воевать, плюс держа в уме что гипервоспаление может привести к иммунопатологии.
Все как положено, вывели антитела которые присоединяются к этим цитокинам и инактивизируют их функцию. Сделали пре-клинические эксперименты используя мышей. В перитонеальную полость вводили  бактерии (E.coli) а потом лечили антителами. Результаты ошеломляющие, выживаемость испытуемых животных под 90% из 100.  Эти исследования были проведены знаменитым учёным в этой области доктором Кевином Трейси со своими коллегами.
Следующий шаг логичен это клиническое тестирование антител на пациентах страдающих сепсисом. И тут "непонятка" введение антител не только не улучшает состояние пациентов, но даже ухудшает его, конечно при одновременном лечении антибиотиками и другими препаратами и процедурами.
Здесь то мы и столкнулись с большой проблемой которую исследователи не могли объяснить, ведь та "догма" на которой держался патогенез воспалительной реакции не выдержал самой главной проверки. А значит что исследователи где-то просчитались. Кстати таже история была и с ибупрофеном (не стероидный противовоспалительный препарат), он как положено понижал уровень метаболитов ЦОГ-2 (простагландины, тромбоксаны итд) но не влиял на смертность среди пациентов с сепсисом.
Находились множество объяснений этому провалу, оказалось что у человека при сепсисе уровень цитокинов не такой высокий как при экспериментальной модели на животных. Но так или иначе исследователи должны были согласиться с тем фактом что 1) это просто напросто не работает и 2) что скорее всего воспаление несёт не только разрушительную функцию.

Иммуносупрессия как патогенез сепсиса.
Наверное стоит сказать что сепсис сам по себе конечно не меняется, в плане того что как и в средние века это было заражение крови микробами так и сейчас. Но методы лечения конечно сильно изменились. И если раньше к примеру человек с сепсисом умирал в течении 1-3 дней так как на вооружении врачей того времени были лишь холодные компрессы на голову и какие-нибудь отвары, то сейчас, в значительной степени благодаря открытию антибиотиков, смертность наступает гораздо позже, если вообще наступает, в случаe правильного диагностирования и лечения, и плюс меняется состав пациентов, из года в год "клиентами" сепсиса становятся люди пожилые, а иммунитет пожилых и молодых людей значительно отличается, и в данном случае имеет место быть такой процесс как иммуностарение (эта тема достойна отдельного сообщения).  И на мой взгляд здесь то и пошёл перекос понимания, восприятия роли воспалительного процесса, в большей части из-за быстрого скачка терапевтических методов.
Итак что мы видим, если взять классический пример динамики числености лейкоцитов в крови во время сепсиса (вне зависимости экспериментальный или клинический) то в первые 1-3 дня мы будем наблюдать повышенное содержание лейкоцитов (в большей части нейтрофилы) и провоспалительных медиаторов (цитокины, хемокины, простагландины), в дальнейшем уровень будет понижаться и может достичь нейтропении, парелельно этому уровень провоспалительных цитокинов также понижается когда как противовоспалительные медиаторы увеличиваются (IL-10, TGF-beta).

 И интересно то что септические животные не умирают в первые дни а начинают примерно с 3 по 4-5 день.  Примерно также и в клинике, благодаря современным технологиям и препаратам сейчас 7 дневная выживаемость гораздо выше чем раньше. Следовательно, в поздней фазе сепсиса мы имеем дело уже с иммуносупрессией и иммуноистощением нежели с гипервоспалением иммунных клеток. Об этом утверждают не только лабораторные исследования но и клинические, так например многочисленные работы Hotchkiss RS и Coopersmith CM из Вашингтоского университета, штат Миссури, указвают на важность иммуносупрессии в патогенезе сепсиса. Также другие исследователи задокументировали повышенную предрасположенность септических пациентов к вторичной инфекции, вирусам (Herpes simplex virus, cytomegalovirus), грибковым патогенам (Aspergillus) и всё это на фоне иммуносуппрессивной фазы во время сепсиса.
Так что в заключение воспалительную фазу можно и нужно делить как минимум на две координально отличающихся друг от друга фазы это иммуновоспалительная и иммуносуппресивная фаза, и соответственно лечение должно зависеть в какой фазе находится пациент.


Большое спасибо док. Ни Александру за критику к этому сообщению.

Литература:
Nat Med 15: 496–497, 2009.
Nat Rev Immunol. 2013 Dec;13(12):862-74
Trends Mol Med 2014 Apr;20(4):224-33
Minerva Anestesiol. 2013 Dec;79(12):1396-405.
Am J Respir Crit Care Med 175: 935–942, 2007
N Engl J Med. 1997 Mar 27;336(13):912-8.