пятница, 17 октября 2014 г.

NET микробам.

Помню, первый раз встретил в pubmed такой термин как NET, и ничего не понял, тогда ещё учился на магистратуре. В целом конечно очень интересный феномен нейтрофилов. Примерно представляю как этот эффект был обнаружен: исследователь делает визуализацию ДНК, а у него вместо того чтобы хороший, красивый, концентрированный стэйнинг ДНК в ядре, размазня какая-то получается, делает раз, делает два....на 135 раз думает нет скорее всего так и должно быть, посмотрел внимательно, выглядит как паутина ну тогда давайте назовём этот размытый ДНК NET что полностью звучит как Neutrophil Extracellular Traps (нейтрофильные внеклеточные ловушки).  Вы не подумайте, я конечно не знаю историю открытия NETs, но почему-то мне кажется что это происходило примерно так, просто сами подумайте фагоцитоз и релиз бактерицидных пептидов, эти два процесса куда сложнее по механизму, в них вовлечено очень много различных молекулярных механизмов начиная от перестраивания клеточной мембраны, ассемблирования филаментарного актина в цитоплазме и активация сигнальных молекул, говорит о том что к примеру фагоцитоз очень сложный процесс и скорее всего сложнее чем NETоз. Так почему же NET обнаружили относительно недавно, а фагоцитоз был ещё описан Ильёй Мечниковым? Лично у меня только один ответ, сам эффект наблюдали и раньше но никто не додумывался что это несёт какой-то функциональный характер, размазанный ДНК ну что поделаешь надо будет завтра повторить этот эксперимент заново.

А начиналось всё...
Как у любого большого показа кино, сначала выпускают трейлер...все смотрят трейлер а потом думают фильм должен быть вот такой..... В науке примерно тоже самое, любое значимое открытие, а NET на мой взгляд именно к таким и относятся, не открывается само по себе всегда существуют предшествующие исследования которые были близки к разгадке но в тоже время не до конца объяснили феномен. Так одни исследователи показали что гистоны обладают бактерицидным эффектом, звучит странно, правда? Как так гистоны, сугубо ядерные белки, которые наматывают на себя ДНК как верёвку на бобину, убивают бактерии, ну хорошо может и убивают, но смысла никакого т.к. чтобы убить патоген надо находиться во внеклеточном пространстве ну на "крайняк" в цитоплазме. А исследователи упёрлись убивает и всё, данные показывают то что показывают, другой интерпретации у нас нет. Ну ладно опубликовались они в своём Nature и бог с ними.
Cover Page of Science magazine in 2004. 
А в этот момент тот человек делал свой 134 стэйнинг, и когда вышла статья про гистоны закричал: "ЭВРИКА!!!!" (шутка конечно)
Функции:
Здесь всё просто, давайте зададим вопрос по другому, вообще зачем рыбаку сеть? Чтобы ловить рыбу и размер рыбы будет зависеть от размера ячеек в сетке. Примерно также и с NETs, сеть из ДНК которую распускают нейтрофилы ловит микробы, вирусы и другие патогены с целью их уничтожения. Уничтожают кстати те самые гистоны которые прикреплены к ДНК а также другие протеины и пептиды которые обладают бактерицидными свойствами. Другими словами NETs физически удерживают патоген в очаге инвазии и не дают ему распространиться в другие места, а также влияют на жизнедеятельность патогена благодаря протеинам которые прикреплены к ДНК.
(Описание к картинке: фотоснимок с электроного микроскопа который наглядно показывает как  Staphylococcus aureus захвачен NETs. )
 И было бы всё хорошо если бы всё было так однозначно, во первых сам по себе экстрацелюлярный ДНК вызывает воспалительную реакцию, может конечно в плане инфекции это где-то и нужно и даже полезно (хотя "полезно" надо использовать здесь аккуратно), но чрезмерная или ещё хуже неконтролируемая воспалительная реакция может привести к иммунопатологии. Во-вторых, это относится к многим ядерным белкам которые в ядре носят важные и нужные функции по регулированию структуры ДНК, но во внеклеточном пространстве также являются медиаторами воспаления (один из ярчайших примеров HMGB1), в связи с этим например в аутоиммунных заболеваниях NETs это уже плохо, в частности множество исследований показывают что NETs влияют на патогенез системной красной волчанки.
Ну и  в-третьих, эти нейтрофильные ловушки не избирательны, грубо говоря они ловят всё что попадётся, так например они могут ловить и аккумулировать тромбоциты что может привести к тромбозу кровеносных сосудов.
Механизм:
Долгое время, вообще-то нет.... изначально формирование NETs было описано как одна из форм смерти клетки, в отличие от апоптоза где всё конденсируется внутри и некроза где наоборот весь клеточный контент выбрасывается наружу, у нейтрофилов был задокументирован третий вид смерти NETоз, когда клетка умирая освобождает клеточный ДНК, в дальнейшем было определенно функциональное значение NETs что было описано выше. Так или иначе, считалось что когда нейтрофилы истощают все свой запасы (лизосомы) и возможность фагоцитировать дальше микробы они используют третье и последнее своё оружие NET.
Скептики даже считали и наверное считают что это никакой не третий вид смерти нейтрофилов а просто во время некроза клетки, клеточная мембрана перфорируется и ДНК пассивным путём высвобождается во внеклеточное пространство.
В 2012 году канадская группа публикует статью в Nature Medicine в которой они утверждают что формирование NETs такой же динамичный клеточный процесс как например релиз лизосом или фагоцитоз и более-того что после NETоза нейтрофилам не обязательно умирать, они также могут продолжать фагоцитировать и мигрировать в тот участок ткани где они нужны. В подтверждение своим наблюдениям они ссылались на ряд работ проделанных Йельском университете в далёком 1989 году где исследователи показали что без-ядерные нейтрофилы обладают хемотактическими, бактерицидными и фагоцитарными функциями. Интересно то что в том далёком 1989 году, исследователи конечно не думали о каких-то там ловушках, проделывали они свои исследования для того что-бы при заморозке и разморозке нейтрофилы  не погибали. Так к примеру если взять фибробласты то при за- и разморозке (конечно при определённой техники) некоторые конечно умрут, около 10%, но в целом большая часть клеток будет вполне здоровой, но с нейтрофилами по другому они более чувствительны к таким перепадам температур, и при разморозке их клеточное ядро лопается, поэтому исследователи решили просто избавиться от ядра и тем самым при за- и разморозке нейтрофилы (хотя их уже и нейтрофилами то не назовёшь, они использовали термин цитопласт) не погибали и не много теряли в функциональном плане.
Но вернёмся в 2012, исследователи показывают что NETоз это не "лебединая" песня нейтрофилов а вполне динамичный процесс и после него без-ядерные нейтрофилы также передвигаются и уничтожают патогены.
Если развивать эту тему, то на мой взгляд это имеет под собой почву, в целом не все клетки в нашем организме имеют клеточное ядро, эритроциты например не имеют и это не мешает им выполнять их функцию. Во-вторых, нейтрофилы это коротко живущая клеточная популяция, в зависимости от вида их жизненный цикл в то время когда они мигрируют в ткань от 24-48 часов, когда как теже самые эритроциты живут и функционируют до 120 дней.
В следующем году таже канадская исследовательская группа публикует обзорную статью в которой обсуждают о двух потенциальных механизмах, суицидальный NETоз и живой NETоз. Но скорее это больше пока в теории нежели на практике....
Если разбирать молекулярный механизм образования NET, то эта область очень слабо изучена, известны лишь общие принципы, например вовлечение ROS (reactive oxygen species), тех или иных рецепторов TLR-2, или -4 в зависимости от грамм- положительности или отрицательности патогена, но все эти молекулы и медиаторы также вовлечены в фагоцитоз, хемотаксис и другие процессы нейтрофилов, так что никакой конкретики или специфичности молекул вовлечённые только NETоз пока нет.

По моему всё...на сегодняшний момент больше неизвестно, по крайне мере я больше не знаю :).

Литература:
Blood: 122 (16) 2013
Nat Med 2012;18(9):1386-1393.
Science. 2004 Mar 5;303(5663):1532-5
Nat Med. 2009 Nov;15(11):1318-21




пятница, 10 октября 2014 г.

Преследуя плацебо.


Недавно, а точнее 2-го октября, мне выдалась возможность посетить доклад Теда Каптчука (Ted Kaptchuk). Я уже и до этого слышал эту фамилию и примерно знал чем этот человек занимается, но на чём конкретно фокусируются его исследования это было для меня неизвестно. По правде говоря, в этот день в разных корпусах нашего госпиталя было два доклада которые меня интересовали помимо док. Каптчука было ещё что-то на тему эндотелиальных клеток и их роль в атеросклерозе или что-то в этом роде, точное название второго доклада я не помню. Грубо говоря была такая дилемма, с одной стороны плацебо что во многих умах (включая в какой-то степени и мой) где-то, как-то граничит с неестественными, может быть даже потусторонними способностями организма. С другой стороны, "чисто" научный доклад на тему кардио-васкулярных заболеваний, роль и функции определённого вида клеток в этих процессах.

Как понятно по теме этого сообщения в итоге я выбрал плацебо, меня всегда интересовал этот вопрос, но в тоже время я достаточно скептически относился и отношусь к такому роду вещей как биополе, внутренняя энергетика итд. Соответственно я и не слежу за этими вещами но где-то, от кого-то слышал что биополе это научно доказанный факт, может так оно и есть, но скажем так, насколько сильно влияет это биополе на качество нашей жизни, здоровья? И здесь мнения разделяются значительно кто-то утверждает что очень сильно влияет, чуть-ли не утверждая что биополе это краеугольный камень в нашей деятельности, кто-то наоборот говорит что это полная чушь. Моё мнение, ну наверное у меня нет своего мнения на сей счёт так как опять упомяну что не интересуюсь такого рода литературой. Но скажу точно что если у меня будет лёгочная инфекция то я начну пить антибиотики а не "заряжённую" через телевизор воду.

Но плацебо стоит особняком, это действительно научно доказанный эффект и сейчас любое клиническое тестирование нового препарата проходит опираясь не на контроль (в плане не леченная группа) а на плацебо, ВСЕ исключений нет.

Немного о Теде:

Хочу немного коснуться его биографии, но не в плане где родился, или какие-то другие даты из его жизни. Но интересно то что после окончания медицинского колледжа в штатах, в отличие от наверное 99.999% своих коллег которые поступают на резидентуру или начинают работать общими терапевтами, док.Каптчук уехал в Китай изучать восточную традиционную медицину, а в частности иглоукалывание. После возвращения в штаты он начал исследования в области иглоукалывания как альтернативный метод лечения. То-ли идея была не очень, то-ли результаты не обнадёживающие, или просто пропал интерес, но в итоге он пришёл (в плане исследовательской деятельности) к плацебо и сейчас возглавляет Harvard-wide Program in Placebo Studies and the Therapeutic Encounter другими словами "главный" по плацебо ибо других центров или программ у нас нет. Наверное из всего этого можно заключить что изначально док. Каптчук думал и действовал не как все, по крайне мере не как большинство, и в плацебо исследованиях он не первый день, поэтому на мой взгляд его мнение можно считать экспертным.


Image from Nature Reviews Drug Discovery 12, 191-204 (2013)
О плацебо:
Как говорится не всё плацебо это плацебо, просто многие путают плацебо эффект с так называемым шумом (noise), когда пациенты получаемые плацебо реагируют на него, но эта реакция идёт независимо от плацебо (что само-собой нельзя отнести к эффекту плацебо) к таким изменениям относят как естественный процесс болезни, или когда пациент намерено вводит в заблуждение себя и доктора говоря что те или иные симптомы болезни изменились после принятия препарата (плацебо).
Плацебо сам по себе также может быть разным, и существует два основных типа плацебо. 1) это наверное многим известный dummy treatment, или просто обман, когда вместо лекарства дают пустышку или в случае иглоукалывания вместо настоящих игл используются fake иглы которые не проникают в тело. 2) это психологический контекст окружающий пациента. Один из наверное наиболее известных примеров это открытое лечение (open treatment) и закрытое лечение (hidden treatment). В первом случае врач или мед-сестра "открыто" говорит что будет вводить Х препарат и после него пациенту должно стать легче. Второй метод это если вводить тот же самый препарат пациенту в той же самой дозе, в абсолютно одинаковом режиме но не говоря ему ни слова об этом, не открывая флакон с лекарством перед ним итд. В обоих случаях препарат будет действовать, но динамика у открытого лечения будет лучше т.е. препарат будет действовать быстрее и эффективнее и эта разница между открытым и закрытым лечением тоже относится к плацебо эффекту.

Если говорить о конкретной деятельности док. Каптчука, то мне особенно запомнились 3 его заключения основанные на исследованиях его центра. 1) Плацебо имеет "дозу", к примеру открытое лечение, если пациенту объявить что сейчас будут вводить лекарство это один эффект, а если сказать что пациенту будут вводить лекарство, при нём открыть флакон, и вводить лекарство так чтобы пациент это видел то эффект будет уже другим (сильнее). 2) существует группа людей которые подвержены плацебо эффекту (сразу хочу сказать что эта область слабо изучена в целом и док. Каптчуком в частности) но данные говорят о следующем: группа док. Каптчука давала пациентам "открытое" плацебо это значит пациентам прямо говорили что он принимает плацебо, а не лекарство. Исследования проводились над людьми страдающие мигренью. Честно говоря, я чуть не упал со стула когда док. Каптчук сказал что у людей принимающие пустышки и знающие об этом наблюдалось облегчение от мигреней, конечно не на таком уровне как у людей принимающие анальгетики но результаты были статистически значимы.  и 3) плацебо не влияет на патофизиологию болезни но значительно влияет на субъективные симптомы. В этом случае док. Каптчук и его коллеги делали исследования над пациентами страдающие астмой. Плацебо никак не влиял на параметры объема форсированного выдоха как например это делал альбутерол (сальбутамол). Но когда эти пациенты отвечали на вопросник о качестве жизни до и после приёма препарата или плацебо то оказалось что альбутерол и плацебо леченные группы не отличались друг от друга.

Вопросы - ответы:
Один из слушателей спросил: Есть ли разница в эффективности плацебо в зависимости от болезни, например неврологические против аутоиммунных заболеваний?
Ответ: эффект плацебо более "ярко" проявляет себя в неврологических расстройствах, хотя конечно какие-то временные улучшения могут наблюдаться и в других заболеваниях.

Другой слушатель спросил о потенциальном механизме действия плацебо?
Ответ: Механизм не известен, но однозначно это связано с нейробиологией, нейрофизиологией человека. Дальше он чтобы прояснить ситуацию которая витает вокруг эффекта плацебо, док Катпчук заявил в следующем ключе, На сегодняшний день не существует ни одного исследования которое бы показывало что к примеру плацебо уменьшает размер раковой опухоли. Поэтому говорить о терапевтических свойствах плацебо нет смысла. Но изучение в этой области крайне важны для клинической медицины с той позиции что плацебо в сильной и значительной мере может влиять на эффективность препарата, на его фармакодинамику и другие важные параметры .

Литература:

NEJM 2011, 365: 119-126
Lancet 2009; 374:1234-5
BMJ 2008; 336: 998-1003
PLoS One 2010; 5: e15591