Про-резолюционные медиаторы воспаления: Липоксины и Aспирин-индуцированные липоксины

Некоторое время назад, я написал сообщение под названием "Резолюция Воспаления" (ссылка http://naukageek.blogspot.com/2014/05/blog-post_8.html). В нём, я рассказывал что уменьшение воспалительной реакции это активный процесс, а не пассивный как это раньше считалось. Я также слегка упомянул о медиаторах резолюции, и в этом сообщении я расскажу более подробно об одном семействе про-резолюционных медиаторов это липоксины и аспирин-индуцированные липоксины.
Перед тем как начать хотел бы сказать что в этом сообщении я буду писать названия химических формул на английском языке т.к. не уверен в правильности своего перевода.

Синтез:
Липоксины это trihydroxytetraene-содержащие эйкозаноиды которые являются продуктом метаболизма Арахидоновой Кислоты (АК). Как мы уже знаем, АК является источником многих липидных медиаторов таких как простагландины, трамбоксаны и простациклины, продукция этих эйкозаноидов зависит от активности циклооксигеназы-1 и -2 (ЦОГ-1, -2). В основном, все выше перечисленные липидные медиаторы несут про-воспалительную функцию что конечно же необходимо но в тоже время может преобрести патологический характер если синтез этих медиаторов выходит из под контроля.
В тоже время, АК является субстратом для синтеза про-резолюционных медиаторов такие как липоксин А4 (lipoxin A4, LXA4) и липоксин В4 (lipoxin B4, LXB4). В отличии от простагландинов, производство липоксинов катализируется липоксигеназами -5, -12 и -15 (lipoxigenase -5, -12, -15, сокращенно 5-LO, 12-LO, 15-LO) (Рисунок 1). Как описано на рисунке 1, липоксигеназы катализируют реакцию  присоеденения молекулы кислорода к АК с дальнейшим гидролизированием (с помощью гидролаз) и получением финального продукта липоксин А4 и В4.

Рисунок1

Также было задокументировано что синтез липоксинов может присходить благодоря меж-клеточному взаимодействию. К примеру достаточно хорошо описан путь образования липоксинов при взаимодействии лейкоцитов с тромбоцитами (Рисунок 2). В нейтрофилах при участии 5-LO образуется лейкотриен А4, который транспортируется в тромбоциты, содержащие 12-LO, и синтезируются  липоксины.

Рисунок2

Аспирин на рынке с 1897 года (более 100 лет), но свои корни этот прапарат берёт ещё со времён Гиппократа который использовал экстракт коры ивы (содержащий салицин) в медицинских целях.
Главная функция аспирина это ингибирование ЦОГ -1 и -2 путём ацетилирования серина 530 и серина 516 соответственно. Это ацетилирование приводит к не возможности ЦОГов синтезировать простагландины и др. метаболиты. Вместо этого ацетилированный ЦОГ конвертирует арахидоновую кислоту в 15-R-hydroxyeicosatetraenoic acid (15-R-HETE) которая по структуре очень похожа на промежуточный метаболит в синтезе липоксинов. Процесс ацетилирования был описан в 1975 году и только 1995-ом док. Серхан из Гарвардской Медицинской Школы показал что 15-R-HETE может также присоединять молекулы кислорода под воздействем 5-LO и тем самым производить стереоизомеры липоксинов такие как 15 epi-LXA4 и 15 epi-LXB4, в дальнейшем эти медиаторы были названы как Аспирин-Индуцированные Липоксины (АИЛ) (aspirin-triggered lipoxins, ATLs) (Рисунок 3).

Рисунок 3

Липоксины инактивизируются при помощи дегидрогеназ таких как 15-гидрокси простагландин дегидрогеназа (о функции которой я уже писал, http://naukageek.blogspot.com/2014/05/h-15-15-pgdh.html). Кстати, при сравнительном анализе липоксинов и АИЛ выяснилось что АИЛ более стабильные молекулы с продолжительным эффектом.

Функции:
Как я уже упоминал, липоксины и АИЛ являются про-резолюционными и/или противо-воспалительными медиаторами, благодаря своему воздействию, в первую очередь, на иммунные клетки (Рисунок 4). Их потенциальная польза была задокументированна во многих экспериментальных  моделях стерильного и микробного воспаления такие как астма, колит, фиброз, сепсис, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), люпус эритематозный, ишемия и т.д., а также в некоторых клинических исследованиях.

Рисунок 4

Механизм действия липоксинов и АИЛ до сканально не изучен. В 1994 году был идентифицирован рецептор сопряжённый с G-белком (G-protein coupled receptor, GPCR) который имеет способность присоединять липоксины и был назван как Липоксин А4 рецептор (Lipoxin A4 receptor, ALXR). Соответственно, когда липоксин присоединяется к ALXR, рецептор активизирует многочисленные сигнальные пути включая MAPKinases (Рисунок 4), но активизация MAPKinases не может полностью объяснить тот эффект который несут эти молекулы. Также существуют свидетельства того что липоксины могут действовать независимо от своего рецептора, могут ли они проникать через клеточную мембрану пассивным путем или существуют какиe-то каналы это пока остается неизвестным.

Заключение:
Липоксины и АИЛ являются своего рода уникальными молекулами, они обладают способностью подавлять про-воспалительные процессы и в тоже время активизировать процессы резолюции и восстановления. На сегодняшний момент, эти липидные медиаторы являются потенциальным направлением в лечении множества воспалительно-патологических процессов.

Литература:
Nature. 2014 Jun 5;510(7503):92-101
Annu Rev Immunol. 2007;25:101-37.
Biochim Biophys Acta. 1994 Apr 14;1212(1):1-25.
Br. J. Pharmacol., 139 (2003), pp. 89–98
Braz J Med Biol Res, May 2001, Volume 34(5) 555-566

4 часть. Интервью.

В этом сообщении мы поговорим об интервью. В целом, если вам назначили интервью то шансы  ваши  попасть в лабораторию наверное где-то 80 из 100% и можно с уверенностью сказать что вы ПОЧТИ у цели :).

good day

После анализа вашего резюме, профессор может сделать заключение о том подходите ли вы для его лаборатории или нет. И если он хочет с вами пообщаться, то значит вы подходите!
Я бы не сказал что у меня огромный опыт прохождения интервью. Во время моего поиска пост-дока, я прошёл 2 интервью и ещё 3 профессора хотели пообщаться со мной, но я в итоге не разговаривал с ними так как уже получил и принял приглашение (official offer) от моего нынешнего босса. Но не смотря на свой маленький опыт, у меня были определенные заметки на этот счёт так как вокруг меня было много таких же студентов как и я которые также хотели попасть в хороший университет для прохождения пост-дока. Ну и конечно мы часто обменивались мыслями, опытом и идеями на этот счёт.
В целом интервью идёт по следующему сценарию:
Приветствуете друг друга, потом обычно профессор рассказывает о своей лаборатории (те два интервью которые у меня были, мне реально рассказывали обо всём начиная с того в каком направлении занимается лаборатория кончая сколько людей в лаборатории и количество лабораторских семинаров, кафедральных сборов и т.д, и т.п. другими словами профессор вам расскажет весь быт в лаборатории, обычно это около 20-30 минут, ну вы просто слушаете и вставляете короткие фразы типа I see.... OK.... Yes, I got it .....:) ).
Потом профессор попросит вас рассказать о том чем  вы занимаетесь (по ходу вашего монолога он может параллельно задавать  вопросы, касающееся ваших исследований, меня в основном спрашивали на счёт экспериментов, не забывайте у них ваше CV).
Потом обычно профессор плавно переходит на тему где он/она видит вас в лаборатории, в плане каким проектом он/она хочет чтобы вы занимались, и расскажет вам об идее которую вы будете  воплощать в жизнь....:), обычно это уже более коротко 10-15 минут. С вашей стороны тоже особо много говорить не требуется можете также вставлять короткие фразы типа: I think this is interesting (ну если вам конечно действительно интересно) .... :).
После этого он спросит вас, нет ли у вас к нему вопросы, вы зададите если они есть и всё, интервью пройдено :).
Обычно к концу интервью, профессор расскажет вам дальнейший план действия, например из тех двух случаев моего поиска, оба в целом были довольны мною, один хотел поговорить с моим научным руководителем, а другой сказал что свяжет меня с его секретарём и я начну процесс сбора документов для приезда штаты.
Все что я напишу ниже это лишь моё личное мнение, с которым вы можете согласиться или не согласиться.
Tips:
1) Надо подготовиться заранее :). Например если у вас не очень с английским то лучше некоторые вещи просто заучить. Я практически уверен что профессор спросит о том чем вы занимаетесь и  что вас интересует в науке? Я например реально заучивал текст о том чем я занимаюсь, т.к. все таки когда волнуешься можешь что нибудь забыть.
2) Задавайте вопросы. Обычно после рассказа о своей лаборатории или в конце интервью профессор поинтересуется: нет ли у вас вопросы к нему? Вы можете задать несколько вопросов. Например, я во всех двух интервью спрашивал, поощряет ли он/она если пост-доки пишут гранты и помогает ли он/она в этом деле им?
3) Я думаю что не стоит заводить разговор о зарплате. В плане конечно, я понимаю это очень важный вопрос, все мы любим науку но всем также надо кушать и желательно 3 раза в день. Но в данном случае, я считаю этот вопрос бесполезным т.к. все пост-доки приезжают на уже выигранные гранты и скорее всего это будет NIH грант. А в NIH (да и во многих других организациях) есть уже готовая шкала, сколько пост-док будет получать в зависимости от опыта работы. Профессор будет либо следовать этой шкале либо нет, в плане меньше чем рекомендует NIH, больше он вам платить не сможет :). И ещё одна причина в том что интервью это лишь интервью, вы сможете сказать себе что "всё сделано!!!" только когда получите официальное приглашение (там кстати и будут прописаны цифры) и дадите своё согласие, а до этого вам ещё никто, ничего не обещал. И конечно после получения приглашения вы ещё можете отказаться.
Ну вот и всё...желаю вам удачи в ваших поисках.

Губит людей не ПИВО, губит людей......Ревматоидный Артрит

Когда увидел эту статью, честно сказать "про себя" улыбнулся :) так как сам люблю пропустить бокал разливного пива, где-нибудь в тихом баре после жаркого и интенсивного дня.
Эх пишу, и прям сейчас захотелось..... :)

Выходные в Мэне

Итак:
Недавно опубликованное исследование под руководством профессора Bing Lu из кафедры Ревматологии, Иммунологии и Аллергологии, Гарвардской Медицинской Школы показало что употребление умеренного количества пива сокращает шанс  развития ревматоидного артрита среди женщин. В исследовании  принимали участие 238,131 лицензированных  мед. сестер  из Brigham and Women Hospital. Женщины каждые 2 года в течение всего исследования отвечали на вопросы о стиле их жизни и состояния  здоровья. Каждые 4 года мед сестры заполняли опрос о своей диете, включая как часто употребляли алкоголь. Также отвечали что именно пили вино, пиво или любой другой напиток!
Суммарно было анализировано около 1.9 миллионов человеко-лет и выяснилось что умеренное употребление пива, примерно 2-4 бокалов пива в неделю,  уменьшает шанс развития ревматоидного артрита на 31% по сравнению с женщинами которые никогда не пили пиво. Так как в исследовании принимали участие только женщины доктор Lu и его коллеги не могут сказать распространяется ли этот эффект на мужчин (к сожалению).

В заключении можно сказать что исследователи нашли корреляцию между употреблением пива в течении долгого времени, в умеренных количествах и уменьшением риска развития артрита среди женщин.                                                                                                                              .
Будущие исследования также необходимы чтобы подтвердить данную корреляцию  в других популяциях.

Литература:
Arthritis Rheumatol. 2014 Apr 11. doi: 10.1002/art.38634. [Epub ahead of print]

Врождённые Лимфоидные Клетки (Innate Lymphoid Cells)

Врождённые лимфоидные клетки  (ВЛК) это группа лимфоцитов которые вовлечены в быстрое цитокин-зависимое реагирование организма во время воспалительного процесса.
Они играют важную роль в гомеостазе органов тканей и в иммунном ответе организма на  внешние раздражители а также регулируют процессы развития клеток приобретённого иммунитета.
В отличии от "обычных" лимфоцитов приобретённого иммунитета у ВЛК отсутствуют антиген-специфичные рецепторы, они могут реагировать на широкий спектрум воспалительных стимулов.

Как и Т-хелперы, ВЛК имеют общего предшественника охарактеризованного как клетка экспрессирующая транскрипторный фактор inhibitor of DNA binding 2 (ID2).

На сегодняшний день выделяют три группы ВЛК в зависимости от их функции и экспрессии воспалительных медиаторов (Рисунок 1).

1-ая группа ВЛК делят множество характеристик с естественным киллерам (ЕК) (Natural killer, NK cells). Также как и ЕК, 1-тип ВЛК экспрессируют интерферон-γ и нуждаются в транскрипторном  факторе Т-bet для своего развития, но в отличие от ЕК, они нe экспрессируют перфорин, гранзим В (granzyme B) и рецептор киллерных клеток (Killer-cell Ig-like receptor) и также активизируются в основном на интерлейкин-7 (ИЛ-7) чем ИЛ-15. Высокое содержание 1-го типа ВЛК были обнаружены в кишечнике пациентов страдающие болезнью Крона.

2-ая группа ВЛК имеют способность продуцировать ИЛ -13, -5 и -9. Впервые эта популяция клеток была описана в контексте анти-гельминтной реакции организма. Исследователи показали что 2-ой тип ВЛК стимулирует эозинофилию и гиперплазию бокаловидных клеток, два важных процесса в анти-глистном ответе организма. Также недавно, 2-ой тип ВЛК был обнаружен в лёгких и играет важную роль в патофизиологии астмы. Для дифференциации во 2-ой тип ВЛК необходима активация таких транскрипторных факторов как  retinoic acid receptor–related orphan receptor (ROR) α и Gata3.

3-я группа ВЛК для своего развития также нуждаться в Gata3 и ROR-γt. Эта группа  делится на 3 под-группы. 1) Клетки индуцирующие лимфоидную ткань (Lymphoid tissue inducer, LTi) , они необходимы для лимфоидного органогенеза и продуцируют ИЛ -17 и -22. 2) ИЛ-22 продуцирующие ВЛК (natural cytotoxicity receptor, NCR позитивные) учавствуют в защите организма от внешних патогенов.  3) ИЛ-17 продуцирующие ВЛК (NCR негативные) были обнаружены у пациентов страдающие язвенным колитом, также существуют исследования показывающие вовлечение этой группы клеток в прогрессии астмы и других аллергически-воспалительных процессах.

Рисунок 1

Что мы знаем....
ВЛК это новая популяция лимфоцитов, охарактеризованная относительно недавно.

ВЛК может продуцировать широкий спектрум цитокинов.

ВЛК реагирует в НЕ антиген зависимой манере.

ВЛК функционируют независимо от клеток приобретённого иммунитета но в тоже  время влияют на приобретённый иммунитет.

Что  не знаем.....
Как ВЛК взаимодействуют с клетками приобретённого иммунитета т.к. Т-хелперы.

Изначально ВЛК это очень малочисленная популяция клеток но в критических ситуациях (воспаление, защита от инфекционных патогенов),эта популяция клеток резко увеличивается. И остаётся неизвестным механизмы запускающие экспансию ВЛК.

Существуют ли дополнительные саб-группы ВЛК?

Литература:
Nature Reviews Immunology (2013) 13, 75-87
Immunology and Cell Biology (2013) 91, 215–224
Curr Opin Immunol (2014) 27, 75–82

Идея на 1 000 000 $ :)

Еду сегодня в метро, ну всё как обычно вагон запоненый, но не битком, едим. И вдруг я слышу музыку "хэви метал" оборачиваюсь а в полуметре от меня стоит молодой человек (скорее всего студент колледжа или high school student) в наушниках слушает свой хэви метал и настолько громко что даже я слышу что это "Metallica". И тут я вспомнил рисунок из книги по биологии в нём был описан один эксперимент, где растение ставили под разный тип музыки классическая или рок. Ну и понятно что под рок растение увядает и погибает, а под классическую растёт и пахнет :).
И я подумал:
Надо разделить 30 мышей на 3 группы одна в течении 2-х недель будет слушать классическую музыку, вторая хэви метал а третья контроль. Через 2 недели (after exposure) вводим во все группы E.coli в количестве 10 млн интраперитонеально, что вызовет инфекционно-воспалительную реакцию (один из видов экспериментальной модели сепсиса). Через 24 часа, анестезируем мышей и экстрагируем кровь, печень, почки, лёгкие, берём также перитонеальный лаваж (site of infection). Кровь отправляем на antibody array для анализа уровня цитокинов и хемокинов и других воспалительных циркулирующих протеинов (можно детектировать до 100 цитокинов и хемокинов, cool!!!). Из всех органов экстрагируем РНК для microarray analysis (можно прогнать весь геном животного, тоже круто!!!) чтобы определить потенциальные кандидаты (гены) которые имеют разный уровень экспрессии в разных группах, и тем самым могут быть потенциально ответственны за терапевтический эффект классической музыки, и в тоже время негативный эффект хэви метал во время сепсиса. Перитонеальный лаваж также отправляем на antibody array т.к. уровень циркулирующих цитокинов и цитокинов в источнике воспаления могут отличаться. Иммунные клетки из перитониальной полости подвергаем multiple staining для Flow cytometry анализа. Меня лично интересует, какая популяция моноцитов будет превалировать в "классической" группе (Ly6C high, Ly6C dim, или Ly6C low), и будет ли разница между группами в уровне T reg лимфоцитах это меня тоже очень интересует, т.к. недавно исследователи определили что высокая смертность от сепсиса корелируется с высоким уровнем Т reg клетками в пациентах.
Основываясь на этих результатах, можно смело писать статью и подавать её в Nature Immunology :).
А пока будет идти revision процесс, надо задуматься ещё над одним вопросом. Я ведь мышей подвергал сепсису когда им было 8-10 недель а это уже считается взрослые мыши, но ведь хеви метал слушают в основном дети и подростки и иммунная система детей сильно отличается от взрослых, хммм придётся повторять эксперимент но уже с более молодыми мышами. Также будет интересно сравнить хэви метал с русским роком (Виктор Цой, Наутилиус Помпилиус, ДДТ итд), так как я не считаю что русский рок несёт какое-то деструктивное влияние.

И вдруг диспетчер говорит: "Now you are arriving on JFK/UMass, doors will open on the left side of the train, please do not forget your belongings". Это моя станция.... 

Общий обзор создания Нокаут, Нокдаун, Tрансгенныx и Условный нокаут (Cre-Lox system) мышей.

Pисунок1

Давно хотел написать это сообщение, т.к. когда пишу свой посты в блоге постоянно говорю: "Х ген дефицитные мыши, или мыши у которых отсутствует Х ген показали высокий уровень .... чем контрольные животные", в плане постоянно приходится увёртываться т.к. я не уверен что все кто читает мой блог знают например разницу между нокаут и нокдаун мышами.
Поэтому решил всё описать в одном сообщении чтобы в дальнейшем делать ссылку на этот пост.

Если очень коротко и поверхностно, то
Нокаут-это когда Х ген отсутствует в принципе, поэтому нет и РНК кодирующий этот ген и соответственно протеина.
Нокдаун-это когда Х ген присутствует в клетке или животном, и даже РНК синтезируется но дальше дело не идёт, т.к. РНК в данном случае разрушается и соответственно до протеина дело не доходит.
Трансгенные мыши-это те мыши которым внедрили Х ген, например в мышку можно "легко" заставить экспрессировать любой человеческий ген и смотреть какую функцию он играет в физиологических или патофизиологических процессах.
Условный нокаут-это самое последнее слово техники. В этом случае нокаут гена происходит при определённых условиях или только в определённых видах клеток. Например, многие нокаут мыши эмбрионально летальные что делает не возможным исследования этих мышей во взрослом периоде. И условный нокаут решает эту проблему тем что Х ген нокаутируется только при определённых условиях (при кормлении определёнными препаратами).

Если люди особо не интересуются "hard core" биологией, то это знания минимум которые помогут вам разобраться что к чему...:).

Я в основном буду фокусироваться на нокаут и условный нокаут моделях.
Развитие нокаут мышей (и в целом технологии) получило своё признание в 2007 году когда три исследователя Mario Capecchi, Oliver Smithies и Martin Evans получили Нобелевскую премию по Медицине за свои работы в области развития нокаут животных.
В целом в основе нокаут мышей лежат два фундаментальных открытия в области биологии и генетики это выделение и охарактеризование мышиных эмбриональных стволовых клеток и гомологичная рекомбинация.
Со стволовыми клетками, я думаю особо объяснять не надо, это клетки которые обладают способностью самообновляться и дифференцироваться в любую ткань. 
Гомологичная рекомбинация это также давно известный процесс обмена идентичными последовательностями нуклеотидов между двумя молекулами ДНК.
Так вот умные люди взяли и объединили эти два открытия для того чтобы создавать животных у которых будет отсутствовать любая часть генома, и тем самым изучать эту часть генома как loss of function.
Схематически всё очень просто (далеко не очень просто на практике, но я не буду говорить о трудностях выведения нокаут мышей, просто скажу что на получение таких мышей если тебе повезёт, в лучшем случае уходит 1 год интенсивной работы).

Всё начинается с того что, вы конструируете плазмиду (вектор) в которой по флангам будут последовательности гомологичные последовательности ДНК хозяина, а в центре будут располагаться те экзоны или экзон (или любая последовательность которая вам интересна) которые вы хотите удалить (Pисунок 2). Доставляете (трансфектируете) свою плазмиду в эмбриональную стволовую клетку, чаще всего исследователи используют электропорацию. И благодаря гомологичной рекомбинации плазмида должна интегрироваться именно там где вы хотите удалить желаемую последовательность. Обычно вместо желаемого экзона в плазмиду вставляют антибиотик резистентный ген, в большинстве случаев это Неомицин резистентный ген "neo r" (рисунок 2). Так как уровень трансфекции очень низкий благодаря лечению G418 (аналог неомицина, но в отличие от неомицина токсичен для клеток млекопитающих), вы сможете селектировать трансфектированные клетки (которые будут нести антибиотик резистентный ген) от не трансфектированных, трансфектированные выживут т.к. несут neo r ген а не трансфектированные умрут. выжившие клетки будут создавать колонии, вы собираете и подтверждаете на ПЦР что трансфекция есть. Далее вводите эти стволовые клетки в бластоцисту мышки и в итоге рождается химерная мышь (некоторые клетки будут нокаут, а некоторые нет). Вы скрещиваете эти химерные мыши между собой несколько раз и в итоге получаете чистую колонию нокаут мышей....:).

Pисунок 2

Условный нокаут происходит примерно по той же схеме, только в добавок к этому методу используют Cre-Lox систему. Пример: на рисунке 3 когда вы конструируете свою плазмиду вы вставляете маленькие последовательности 34bp LoxP перед желаемым экзоном, после и после neo r гена (обозначены как треугольники). Трансфектируете, делаете антибиотик селекцию и потом трансфектируете вектор несущий  Cre рекомбиназу. Cre  рекомбиназа узнаёт LoxP последовательности и разрежит вам вашу встроенную плазмиду в трёх вариантах, вам нужен 3-й вариант где желаемый экзон будет флангираваться LoxP последовательностями. Благодоря ПЦР подтверждаете желаемую последовательность и инъектируете эти стволовые клетки в бластоцисту. После того как вы получили чистую колонию скрещиваем её с мышами несущие ген Cre рекомбиназы. Отпрыски будут нести две плазмиды в своём геноме это LoxP-ген-LoxP и Cre. Cre рекомбиназа будет резать LoxP последовательности и тем самым удалять нужный вам ген (рисунок 3 и 4).

Pисунок 3

Если вы ходите чтобы ваш нокаут происходил только в определённом типе клеток (нервные, эпителиальные, иммунные итд клетки) то в Cre плазмиду надо вставить промоутерную часть того гена который экспрессируется только в определённом виде клеток. Например, я хочу нокаутировать свой Х ген в скелетных мышцах и нигде более. Для этого надо вставить промоутерную часть гена кодирующий тяжёлую цепь миозина в Cre плазмиду и Cre будет экспрессироваться только в мышцах, и тем самым  удалять Х ген исключительно в мышцах.

Pисунок4

Если мы хотим нокаутировать Х ген во всём организме но только во время эксперимента. То в таком случае, надо создавать слившуюся Cre рекомбиназу с протеином такой как мутированный гормон-связывающий домен эстрогенного рецептора (рисунок 4). В таком случае ваша рекомбиназа будет сливаться с этим доменом и будет оставаться неактивной до тех пор, пока вы не начнёте лечить мышей тамоксифеном, который будет связываться с этим доменом и тем самым Cre будет в активной форме. Тамоксифен зависимая Cre рекомбиназа является одной из самых первых, сейчас также существуют тетрациклин и доксициклин зависимые Cre рекомбиназы.

Техника нокдаун использует совсем другие принципы и механизмы. Не буду писать все детали, но всё сводится к тому что в наших клетках молекула РНК однаспиральная,  двухспиральная РНК существует у вирусов и других патогенов. Тем самым когда в клетке появляется двухспиральный РНК, клетка запускает механизмы деградации этой РНК (защитная реакция). Исследователи используют этот механизм в своих целях. Можно экспрессировать маленький участок РНК (20-30 bp) который будет комплементарен с мРНК, в итоге будет образовываться маленький участок двухспиральной РНК, который и запустит механизм деградации желаемого РНК и соответственно протеин не будет синтезироваться. А всё остальное селекция, инъекция в бластоцисту, химерные мыши всё также.

Написал много, но теперь в будущих постах буду прямо писать нокаут мыши....:).

Литература:
Methods Mol Biol. 2009;530:343-63.
Curr Protoc Cell Biol. 2009 Sep;Chapter 19:Unit 19.12 19.12.1-17.

Микробиом лёгких и респираторные заболевания

Организм человека находится в постоянном взаимообмене с микроорганизмами. Наверное самая тесная связь между нами и ими происходит в нашем кишечнике.

В эти дни, в биологии есть "тренд"  на изучения роли кишечной микробиоты в различных болезненных состояниях организма. И на сегодняшний день существует много статей говорящие о вовлечении микрофлоры кишечника в самых разных патофизиологических процессах, что на мой взгляд даже очень может быть. Также одно из моих сообщении было посвящено описанию различных исследований в области взаимосвязи микробиоты и ожирения ( ссылка: http://naukageek.blogspot.com/2014/05/blog-post_15.html ).

Но кишечник хоть и самый населённый (микроорганизмами) но далеко не единственное место где проживают наши микроскопические "друзья", так например, симбиотные бактерии были найдены в плаценте и мочеиспускательном канале.

Внутренняя поверхность лёгких это очень динамичная среда обитания. Респираторный орган постоянно "бомбардируется" миллионами микроорганизмами через ротовую и носовую полость. Но микрофлора лёгких примерно в 1000 раз менее населена чем микробиом ротовой полости и около 1000000 раз меньше чем кишечник.
В самом начале исследований в  этой области было не мало скептицизма, многие считали что микробиота лёгких мало чем отличается от микрофлоры ротовой полости. Но тем не менее сейчас всё больше и больше статей свидетельствуют что во первых микробиоты рта и лёгких различны по составу и, во вторых, что  микрофлора лёгких здоровых людей сильно отличается от микробиома пациентов страдающих от таких респираторных недугов как фиброз лёгких, хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ), эмфизема и астма.
К примеру в 2011 и 2012 годах вышли в "свет" две работы свидетельствующие что микробиом лёгких здоровых людей отличается от микробиома ХОБЛ пациентов (2011) и кистозного фиброза (2012). В обоих случаях, исследователи говорили о том что микробиом лёгких больных менее разнообразный чем у здоровых людей. Но критики не заставили себя долго ждать, говоря что большинство пациентов кистозного фиброза и ХОБЛ во время обострения находятся под антибиотик-терапией что само-собой меняет микрофлору не только лёгких но и всего организма.

Рисунок 1

Наверное самые интересные данные были получены при сравнений микробиома лёгких здоровых людей и астматиков (Рисунок 1). В этой работе были вовлечены 11 пациентов страдающие астмой (никто из них не принимал антибиотики) и 8 здоровых волонтёров. Исследователи сделали акцент на то что у пациентов было зафиксировано высокое количество микробов из рода Haemophilus и Neisseria которые принадлежат к типу Proteobacteria в лёгких по сравнению с здоровыми лёгкими (Рисунок 1, выделено чёрной линией). Согласно с этим, другое (более раннее) исследование заявляло что высокое содержание бактерий из рода Haemophilus, Moraxella и Neisseria в дыхательных путях также ассоциируются с высоким риском развития астмы среди новорождённых детей.

На сегодняшний день, исследования в области микробиома лёгких на начальном этапе и на многие вопросы пока (надеюсь что пока) нет ответа. Например, неизвестны причины изменения состава микроорганизмов в лёгких во время патологических процессов? являются ли эти изменения следствием или причиной патологии? и можно ли в будущем предсказать по какому сценарию будет развиваться болезнь у пациента основываясь на анализах микробиома его лёгких?

Литература:
PLoS One. 2010;5(1):e8578
PLoS One. 2011;6(2):e16384
Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(15):5809-14.
N Engl J Med. 2007;357(15):1487-95

Берегите Женщин!!!

Диабет является одним из распространенных заболеваний среди мужчин и женщин. Но мало кому известно что, среди пациентов с диабетом 2-го типа, риск ишемической болезни сердца больше у женщин чем у мужчин.

В мае 2014 группа ученных под руководством профессора Rachel Huxley опубликовали работу в научном журнале "Diabetologia" где проводили мета-анализ 858507 участников. Результаты показали что у женщин страдающих диабетом 2-го типа  риск сердечных заболеваний на 44% выше чем у мужчин!
Аналогичные результаты были также в 37 исследованиях опубликованных в 2006, где риск смертности женщин был  на 46% больше чем у мужчин страдающих диабетом!

Доктор Huxley отмечает что в наши дни, протоколы лечения диабета 2-го типа у женщин и у мужчины идентичны но к сожалению показатели кровяного давления, холестерина и сахара в крови у женщин не достигают рекомендуемого уровня (хуже). Избыточный вес является основным фактором риска развития диабета. Huxley объясняет, что мужчинам требуется гораздо меньше веса чтобы развить диабет нежели женщинам. Это может быть потому что,  мужчины обычно прибавляют вес в области живота, а женщины имеют тенденцию накапливать жир в области таза и бедер.
И вполне возможно что женщины в пред- диабетическом состоянии живут дольше чем мужчины. И в последствии анализы и общее состояние женщин в диагностировании диабета хуже чем у мужчин.
Поэтому доктор Huxley и ее коллеги считают что исходя из всех проделанных  исследований следует, что женщин с  фактором риска к диабету нужно наблюдать раньше чем мужчин, чтобы предотвратить ишемическую болезнь сердца, прогрессирование диабета и других осложнений. Это может быть особенно важно для женщин у которых был гестационный диабет (диабет беременных), у таких женщин больше шанс развития диабета 2-го типа.

Также Huxley советует врачам уделять больше внимание пациенткам в пред-диабетическом состоянии и помочь им изменить их образ жизни: добавить физические нагрузки, выбрать оптимальную диету. Все это может влиять прогрессирование диабета 2 типа.


Литература:
Diabetologia. 2014 May 25. [Epub ahead of print]

Роль интерлейкинов 4 и 13 в обурении жировой ткани

Долгое время считалось что нахождение иммунных клеток в жировой ткани считается плохим знаком т.к. иммунные клетки (макрофаги и нейтрофилы) могут усиливать воспалительную реакцию и тем самым влиять на дисбаланс в метаболических процессах жировой ткани.
Я уже писал о бурой и белой жировой ткани и о процессах обурения как потенциальный метод лечения метаболических расстройств как диабет 2-го типа и ожирение(ссылка,  http://naukageek.blogspot.com/2014/05/blog-post_10.html ).

Буквально несколько дней назад две лаборатории независимо друг от друга опубликовали похожие результаты.
1-я работа проделанная в Калифорнийском Университете показали что жир-ассоциированные макрофаги (adipose tissue macrophages или АТМ) выделяют цитокины интерлейкин-4 и -13 во время холода (один из самых мощных индукторов обурения жировой ткани) и эти цитокины нужны для обурения жировой ткани (Рисунок 1), тем самым ломая парадигму что макрофаги в жировой ткани ничего "хорошего" не делают.
2-я работа была проделана в Гарвардской Медицинской Школе и здесь исследователи показали что во время физических нагрузок в организме вырабатывается метеорин-подобный протеин который в свою очередь также стимулирует обурение жировой ткани посредством активации жир-ассоциированных макрофагов и выделения тех же интерлейкина 4 и 13 (Рисунок 1).

Вообще редко когда получается что две независимые лаборатории получают одни и те же результаты подходя к проблеме под разными "углами" :).

Рисунок 1

Источники:
Cell, doi:10.1016/j.cell.2014.03.065, 2014
Cell, doi:10.1016/j.cell.2014.03.066, 2014

Биогенез Митохондрий

Митохондрии впервые привлекли исследователей около 50 лет назад. До сих пор, митохондриальный синтез энергии остаётся одним из самых важных и значимых открытием в науке.
Наверное бесполезно говорить о важности митохондрии в клеточном балансе, просто упомяну несколько интересных фактов: Митохондрии составляют около 10% от всей массы тела взрослого человека и в метаболически активных клетках (мышцы, печень, мозг) митохондрии занимают около 40% от всего объёма клетки.

Рисунок 1. Митохондрия под микроскопом.

Митохондрии-это энергетические заводы клетки (так говорила нам наша учительница в школе) и это чистая правда, но в отличие от настоящих заводов, наши органеллы это очень динамичные "заводы" и существуют два внутриклеточных процесса которые необходимы для нормальной жизнедеятельности это слияние-разделение митохондрий и биогенез митохондрий.
Процесс слияния-разделения (fusion-fission) митохондрии надо понимать дословно, на сегодняшнии момент на 100% неизвестно зачем и почему митохондрии сливаются а потом разделяются и наоборот, но в целом исследователи считают что во время этого процесса происходит обмен генетического материала (митохондриальный ДНК, сокращённо мхДНК). И остановка одного из этих процессов (слияние или разделение) ведёт к серьёзным нарушениям в клетке. К примеру, нарушения слияния-разделения митохондрии были задокументированны в таких патологических процессах как онкогенез и нейродегенерация.

Но сегодня я буду рассказывать о другом немаловажном процессе - биогенез митохондрий (формирование новых митохондрий).
Итак, биогенез митохондрии также очень сложный процесс и к сожалению не до конца изучен. Сложность заключается в том что в этом процессе участвуют более 1000 генов, около 20% всех клеточных протеинов изменяют свой уровень экспрессии во время этого процесса, и также биогенез митохондрии нуждается в слаженной кооперации двух геномов (клеточного и митохондриального).

Весь митохондриальный ДНК млекопитающих кодирует 13 протеинов участвующих в работе митохондрии (составные части дыхательной цепи переноса электронов), остальные протеины из которых состоит митохондрия кодируется ядерным ДНК а это ни много ни мало около 95% всех митохондриальных протеинов. Плюс ко всему транскрипция (считывание РНК) и репликация (удвоение ДНК) мхДНК происходит под жёстким контролем протеинов (кодирующиеся ядерным ДНК).
Несмотря на всю сложность этого процесса, на сегодняшний день выделяют 3 протеина которые считаются "золотым стандартом" биогенеза митохондрий это Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha и -beta (PGC-1alpha и beta), Nuclear respiratory factors (NRF-1 и 2) и mitochondrial transcription factor A (Тfam).

Рисунок 2

Первые двое PGC-1 alpha, beta и NRFs являются регуляторами транскрипции митохондриальных генов находящиеся в ядерном ДНК (рисунок 2). Когда как третий протеин "Tfam" регулирует транскрипцию мхДНК. Конечно существуют множество других протеинов которые напрямую или косвенно влияют на биогенез митохондрии но именно изменения уровня экспрессии этих трёх протеинов используется как маркер биогенеза (чем выше экспрессия тем больше биогенеза митохондрий).

Что нам скажут нокаут мыши?
Мыши у которых отсутвтвует ген кодирующий NRF-1 или -2 нам ничего не скажут, так как они умирают во время эмбрионального развития (что подтверждает значимость биогенеза митохондрии в правильном функционировании организма). Такая же ситуация обстоит и с мышами у которых отсутвует Tfam ген (эмбрионально летальны). Когда как, PGC-1 alpha нокаут мыши в целом мало чем отличаются от обычных мышей, и даже митохондриальный биогенез на должном уровне, хотя многие исследования показывали важность этого протеина в биогенезе. Далее выяснилось что PGC-1 alpha дефицитные мыши экспрессируют в несколько раз больше PGC-1 beta, тем самым компенсируя недостаток своего alpha "собрата".

Для чего это нужно?
Митохондрии "как и всё на свете" стареют что делает невозможным их функционирование, старые митохондрии утилизируются (благодаря таким процессам как аутофагия)  и вместо них клетка формирует новые митохондрии. 
Также митохондрии очень чувствительны к различным клеточным стрессам (оксидативный стресс, воспалительный стимул, микробная инфекция итд) что приводит к повреждению митохондрии, и чтобы поддерживать энергетический баланс клетка запускает механизмы биогенеза новых митохондрии (Рисунок 3). 

Рисунок3

Так например, многочисленные работы из университета Дьюка (Северная Каролина) показали что биогенез
митохондрий 
индуцируется во время эксперимен
тальной модели сепсиса или пневмонии, и играет защитную роль во время инфекционно-
воспалительного процесса путём регулирования апоптоза в лейкоцитах и клетках тканей (лёгкие, печень) и воспалительных медиаторов (цитокинов и хемокинов) (Рисунок 3). В последующем, исследователи из этого же университета нашли прямую корреляцию между высоким уровнем митохондриального биогенеза и выживаемости среди пациентов страдающие сепсисом.
Также высокий уровень биогенеза митохондрий  наблюдается во время физических нагрузок, как адаптивная реакция организма к высокому расходованию энергии.

В целом можно заключить что формирование новых митохондрий важный процесс для поддержания гомеостаза, защиты от патогенов и повреждении, а также адаптации организма к "необычным" условиям.

Литература:
Physiol Rev 88: 611–638, 2008
Exp Gerontol. 2008 43(9): 813–819
Mol Cell 14: 1–15, 2004
Mol Cell Biol 21: 644–654, 2001
Nature Genet 18: 231–236, 1998
Am J Resp Crit Care Med. 2010;182:745-751.
Am J Resp Crit Care Med. 2007;176:768-777.

АТФ как медиатор воспаления: Роль пуринергических рецепторов P2XR и P2YR.

Аденозинтрифосфат (АТФ) всем известная молекула которая играет наиважнейшую роль в энергетическом круговороте нашего организма.

Аденозинтрифосфат (АТФ)

Интересно заметить, но АТФ имеет совершенно другую функцию когда попадает во ВНЕклеточное пространство, где АТФ уже играет роль сигнальной молекулы благодаря активации нуклеотидных рецепторов.

К ним относятся пуринергические П2 рецепторы (purinergic P2 receptors), P1 рецепторы активизируются аденином (продуктом распада АТФ) поэтому о P1 рецепторах мы говорить сегодня не будем.

В свою очередь P2 рецепторы по своему молекулярному строению и сигнальным особенностям могут делиться на две саб-группы: P2Y и P2X рецепторы. P2Y это рецепторы сопряжённые с G-белком (G-protein-coupled receptor, GPCR), а P2X рецепторы это ионотропные (по структуре похожи на ионые каналы) нуклеотидные рецепторы.

Освобождение АТФ из внутриклеточного пространства во внеклеточное происходит в основном во время клеточного стресса такие как гипоксия, карциногенез, оксидативный стресс, воспаление.

Рисунок 1

АТФ может выделяться в неконтролируемой манере так например при некрозе когда клеточная мембрана теряет свою целостность и всё что было внутри её (включая АТФ) пассивным путём выходит наружу (Рисунок 1).
Активный транспорт осуществляется благодаря трансмембранным протеиновым комплексам (протеиновые каналы, паннексины и коннексины) которые могут транспортировать внутриклеточный АТФ во внеклеточную среду в ответ на воспалительный стимул или во время апоптоза (Рисунок 1).

P2Y рецепторы:
Главный лиганд для P2Y рецепторов это АТФ.
Эти рецепторы - классические GPCRs они содержат внеклеточный N-конец, внутриклеточный C-конец и семь трансмембранных юнитов (Рисунок 2).

 На сегодняшний день клонировано восемь P2Y рецепторов у млекопитающих это P2Y1/2/4/6/11/12/13/14R.

Рисунок 2

По своим филогенетическим особенностям и последова

тельности эти рецепторы можно разделить на две саб-группы. Первая группа, P2Y1/2/4/6/11R в своей 7-ой альфа-спирали содержат определяющий фрагмент следующей последовательности Y-Q/K-X-X-R (Х-обозначает любая амино кислота). К второй группе принадлежат  P2Y12/13/14 рецепторы и в том же регионе имеют  K-E-X-X-L фрагмент. Также эти группы отличаются тем что "предпочитают" разные G-белки для активации клеточного сигнала.  P2Y1/2/4/6/11 рецепторы присоединяют Gq/G11 что приводит к внутриклеточному освобождению кальция посредством активации фосфолипазы C (phospholipase C) и инозитол-1,4,5-трифосфата (рисунок 2).

Когда как P2Y12/13/14 рецепторы присоединяются к Gi/0 протеинам, которые в свою очередь регулируют ионые каналы.
АТФ может присоединятся и активизировать все P2Y рецепторы за исключением P2Y6R и P2Y14R.

Основываясь на результатах многочисленных исследовании,  P2Y рецепторы не играют важную роль в нормальном состоянии организма. Так например, мыши у которых был удалён ген кодирующий P2Y4R  был замечен слегка пониженный уровень альдестерона, ренина и калия в плазме, но в целом мыши, дефицитные тем или иным P2Y рецептором, не отличаются от контрольных животных.
Но дефицитные животные приобретают яркий фенотип если они подвергаются стрессу (гипоксия, инфекция и др).
В области воспалительных исследовании, наиболее хорошо изучен P2Y2 рецептор, на нём я и остановлюсь более подробно.
Первые попытки лечения воспалительных нарушении пришли из исследований нацеленных на изучение P2Y2R агонистов (активаторов) в лечении кистозного фиброза. С молекулярной точки зрения, кистозный фиброз охарактиризирован как дефект в гене кодирующий трансмембранный регулятор муковисцидоза (CFTR, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) его белок участвует в гипер-абсорбции ионов хлора тем самым вызывая утолщение мукозы, ухудшения функциональности ресничного эпителия в дыхательных путях что и приводит к патологии. Несколько исследовании показали что P2Y2R агонисты могут индуцировать обратный выброс ионов хлора тем самым действуя в противовес работе CFTR. В 2005 году, один P2Y2R агонист (денуфузол) был испробован в клинических испытаниях. К сожалению, этот препарат не показал свою эффективность при длительном употреблении (48 недель, 466 пациентов были вовлечены в это исследование). Скорее всего, причиной была слишком важная роль P2Y2 рецептора в других процессах.

АТФ усиленно экспрессируется мёртвыми клетками давая "найди меня" сигнал и иммунные клетки (макрофаги, нейтрофилы) несущие P2Y2 рецептор могут активизироваться для последующего фагоцитирования (поедания) мёртвых клеток (Рисунок 1).
Высокий внеклеточный уровень АТФ также наблюдается у людей страдающих астмой. Считается что освобождение АТФ с последующей активацией P2Y2 рецептора приводит к повышенному хемотаксису эозинофилов и других иммунных клеток в лёгкие что усиливает аллергическую реакцию.
С другой стороны, активация P2Y2 рецептора положительно влияет на процессы заживления, скорее всего также благодаря усиленному хемотаксису иммунных клеток в место повреждения ткани.
Суммарно можно сказать что АТФ индуцированный P2Y2 рецептор функционирует как "друг" в случае защиты организма от инфекции, ускорения процессов заживления. Противовес, излишняя активация P2Y2 рецептора может привести к неконтролируемому воспалительному процессу (Рисунок 4). В этом контексте, в эти дни ведутся много исследовании нацеленных на антагонисты P2Y рецепторов как потенциальное лекарство в лечении таких хронических воспалительных нарушении как эмфизема.

P2X рецепторы:

P2X рецепторы это клеточные мембранные каналы которые селективны для одно- и двух-валентных катионов (Na+, K+, Ca++) и активизируются АТФ. На сегодняшний момент, они насчитывают семь саб-юнитов (P2X1-7R). Они (саб-юниты) могут образовывать гетеро-тримеры, олигомеры для образования канала, но в не зависимости от набора и количества все они остаются чувствительными к АТФ.

При связывании АТФ с P2X рецепторами происходит приток Na+, Ca++ и отток К+ из внутриклеточного пространства. Увеличение кальция внутри клетки ведёт к активации многочисленных кальций-зависимых сигнальных путей (Рисунок 3).

Рисунок3

Также, P2X  рецепторы могут транспортировать и более крупные молекулы, например, P2X7R при связывании с АТФ подвергается конформационным изменениям что приводит к увеличению поры с последующей транспортировкой самих молекул АТФ внутрь клетки.

В отличие от P2YR, мыши при отсутствии того или иного P2X рецептора имеют определённый фенотип. Так например, P2X1R дефицитные мыши не фертильны или P2X2R нокаут (дефицитные) мыши имеют сильные нарушения слуха. Тем самым можно заключить что некоторые саб-юниты P2X рецепторов не могут быть компенсированы другими в отличие от P2Y рецепторов.

Существует достаточно большое количество научной литературы которая утверждает что P2X рецепторы также играют важную роль в воспалительных процессах. Одна из причин это то что P2X рецепторы, в большей степени, экспрессируются  на иммунных клетках такие как макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки. К примеру, активация P2X7R в макрофагах положительно влияет на уничтожение внутриклеточных патогенов таких как Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia psittaci, Leishmania amazonensis и Toxoplasma gondii. Согласно с этим, клинические исследования обнаружили что люди несущие мутированный P2X7R ген более чувствительны к таким заболеваниям как туберкулёз и токсоплазмоз.
Другие исследования выделяют АТФ-P2X7R сигнальный путь и в хронических заболеваниях. Например, в 2008 году исследователи показали что кишечные бактерии выделяют высокое количество АТФ во время экспериментальной модели язвенного колита (хроническое воспалительное заболевание слизистой оболочки толстой кишки), с последующей активации P2X7 рецептора и генерации Тх17 лимфоцитов (Т хелпер 17 лимфоциты играют важную роль в пропаганде воспаления т.к. выделяют в больших количествах воспалительный медиатор "интерлейкин-17" отсюда и их название) в слизистой воспалённого кишечника.

Рисунок 4

Опять хотелось бы заметить что активация P2Х рецепторов (как и с Р2YRs) может нести как положительный, в случае воспалительно-инфекционных процессов, так и негативный, в случае хронического воспаления, эффект (Рисунок 4).

Заключение:
На сегодняшний день, внеклеточные нуклеотиды это очень интенсивная область био-медицинских исследований так как в потенциале может дать решение многим болезням ассоциирующиеся с воспалительными процессами такие как инфекционные, раковые, сердечно-сосудистые заболевания.

Литература:
Nature. 2014; 509(7500): 310-7.
Nature 467, 863–867 (2010).
N. Engl. J. Med. 325, 533–538 (1991).
J. Cyst. Fibros. 11, 539–549 (2012).
Science 314, 1792–1795 (2006).
FEBS Lett. 486, 217–224 (2000).
Nature Med. 13, 913–919 (2007).
Nature 460, 592–598 (2009).
Nature Med. 18, 600–604 (2012).
Nature 455, 808–812 (2008).