Не так давно шли дискуссии о том нужно ли вводить "hawk eye" систему в наш РФПЛ (хоук ай это камера которая находится высоко над футбольным полем и двигается вперёд и назад по стальному тросу, тем самым можно делать вид сверху и наблюдать передвижение всей команды по полю а также очень полезная вещь в спорных ситуациях в помощь арбитрам, например пересёк мяч линию ворот или нет). И во время этой дискуссии один журналист спросил Станислава Черчесова (нынешний тренер московского Динамо): - Как вы относитесь к введению хоук ай ?
- Хоук Ай для Российской Премьер Лиги как полёт в космос.
Почему-то когда слушал лекцию Дэвида Вайсса из Emory University вспомнил именно это высказывание. И действительно я только, только разобрался с Cre-loxP системой а тут на тебе CRISPR/Cas9 ситема которая и удобнее и эффективнее (http://naukageek.blogspot.com/2014/06/tx-cre-lox-system.html). Как сказал один воротила силиконовой долины: Когда ты покупаешь компьютер, ты покупаешь вчерашний день.
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) это участок ДНК который найден во многих бактериях. CRISPR также называют "иммунитетом" бактерий. Дело в том что CRISPR в ассоциацией с нуклеазами такие как Cas9 могут защитить бактерию от вредных ему вирусов путём разрушения чужеродного ДНК.
В итоге получилась достаточно эффективная штука, которую можно использовать по разному как говорится кто на что горазд, CRISPR/Cas9 система может служить как терапевтический инструмент в лечении генетических заболеваний, скрининга целевых генов в развитии лекарств для лечения болезней которые сейчас не лечатся, ну и само собой CRISPR/Cas9 уже сейчас достаточно активно утилизируется в генной инженерии (например в выведение нокаут мышей, linage tracing мышей, conditional knockout мышей и кстати других млекопитающих такие как крысы, вы не задавались вопросом почему столько нокаут мышей и очень редко кто работает или выводит нокаут крыс? Ответ на поверхности что легче то и выводят).
Как же это работает:
Давайте сначала посмотрим как CRISPR/Cas9 система работает в природе. Для того чтобы этот механизм работал без сбоев, требуются три компонента Cas9, crRNA и tracrRNA.
Cas9 как уже упоминалось это нуклеаза которая собственно и будет резать чужеродный ДНК, но вопрос а почему Cas9, а не -8 или -5? Да существуют и другие нуклеазы, но в биотехнологии используется в основном CRISPR механизм 2-го типа и в нём участвует только Cas9, 2-ой тип это наиболее изученный и наиболее оптимальный, и достаточно простой механизм.
crRNA (CRISPR-RNA) это собственно тот самый РНК (20 нуклеотидов) который комплементарен чужеродному ДНК и будет связываться образую комплекс ДНК-РНК.
tracrRNA (Trans-activating crRNA) это тоже маленький участок РНК который необходим для созревания crRNA.
В итоге crRNA связывается, к примеру, с вирусным ДНК и этот комплекс распознаётся нуклеазой Cas9 и нуклеаза режет две нити вирусного ДНК рисунок ниже.
В лаборатории CRISPR/Cas9 система примерно также, только немного упрощена и нацелена на родной, клеточный ДНК. Первое что предприняли молекулярные биологи это срастили crRNA и tracrRNA и назвали этого гибрида как sgRNA (single guide RNA). И сейчас можно делать трансфекцию лишь одной плазмиды на которой уже будет ваш sgRNA и Cas9 и тем самым убирать любой участок ДНК в геноме клетки (как говориться производить нокаут) рисунок ниже.
Cas9 будет резать нужный вам геномный участок ДНК и это индуцирует механизм который называется Non-Homologous End Joining (NHEJ), в результате этого процесса небольшой участок ДНК где произошло разрезание будет отсутствовать (для лучшего понимания NHEJ советую посмотреть это видео https://www.youtube.com/watch?v=31stiofJjYw ). Также можно внедрить условно говоря любую ДНК последовательность, но для этого помимо всего то что было сказано выше нам понадобится трансфектировать ещё одну плазмиду, которая будет нести собственно ваш ДНК концы которого будут комплементарны концам разрезанного участка ДНК. При этом репарация ДНК пойдёт другим путём так называемым гомологичным сращиванием концов (homology directed repair, HDR https://www.youtube.com/watch?v=86JCMM5kb2A). Внедряют обычно последовательность которая будет либо понижат экспрессию вашего гена (внедрение stop sequence) или увеличивать (activation sequence) рисунок ниже.
Ещё одна особенность этой системы это то что на 3' конце противоположной нити ДНК должна находиться PAM (Protospacer adjacent motif) последовательность, Например для Cas9 из Streptococcus pyogenes PAM это NGG (N-любой нуклеотид). Без этой последовательности процесс невозможен. В помощь исследователям есть множество программ которые смогут найти для вас оптимальную последовательность содержащую PAM.
В целом можно сказать CRISPR/Cas9 система очень полезна для биологов, достаточно быстро можно "нокаутировать" мышей, например если брать механизм гомологичной рекомбинации то исследователи могут затратить в среднем 1-1.5 года на выведение одной линии нокаут мышей, когда как с использованием CRISPR/Cas9 это время сокращается до 6-7 месяцев.
Конечно также есть и свои трудности. Например существует вероятность off-target мутаций. Чтобы исправить этот недостаток существует метод введения двух sgRNA которые нацеливаются на один ген, тем самым вероятность ошибки падает значительно. Плюс можно и нужно проводить скрининг и тем самым избавляться от off-target мутаций (хотя скрининг достаточно трудоёмкое занятие).
Литература:
Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23.
Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63.
- Хоук Ай для Российской Премьер Лиги как полёт в космос.
Почему-то когда слушал лекцию Дэвида Вайсса из Emory University вспомнил именно это высказывание. И действительно я только, только разобрался с Cre-loxP системой а тут на тебе CRISPR/Cas9 ситема которая и удобнее и эффективнее (http://naukageek.blogspot.com/2014/06/tx-cre-lox-system.html). Как сказал один воротила силиконовой долины: Когда ты покупаешь компьютер, ты покупаешь вчерашний день.
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) это участок ДНК который найден во многих бактериях. CRISPR также называют "иммунитетом" бактерий. Дело в том что CRISPR в ассоциацией с нуклеазами такие как Cas9 могут защитить бактерию от вредных ему вирусов путём разрушения чужеродного ДНК.
В итоге получилась достаточно эффективная штука, которую можно использовать по разному как говорится кто на что горазд, CRISPR/Cas9 система может служить как терапевтический инструмент в лечении генетических заболеваний, скрининга целевых генов в развитии лекарств для лечения болезней которые сейчас не лечатся, ну и само собой CRISPR/Cas9 уже сейчас достаточно активно утилизируется в генной инженерии (например в выведение нокаут мышей, linage tracing мышей, conditional knockout мышей и кстати других млекопитающих такие как крысы, вы не задавались вопросом почему столько нокаут мышей и очень редко кто работает или выводит нокаут крыс? Ответ на поверхности что легче то и выводят).
Как же это работает:
Давайте сначала посмотрим как CRISPR/Cas9 система работает в природе. Для того чтобы этот механизм работал без сбоев, требуются три компонента Cas9, crRNA и tracrRNA.
Cas9 как уже упоминалось это нуклеаза которая собственно и будет резать чужеродный ДНК, но вопрос а почему Cas9, а не -8 или -5? Да существуют и другие нуклеазы, но в биотехнологии используется в основном CRISPR механизм 2-го типа и в нём участвует только Cas9, 2-ой тип это наиболее изученный и наиболее оптимальный, и достаточно простой механизм.
crRNA (CRISPR-RNA) это собственно тот самый РНК (20 нуклеотидов) который комплементарен чужеродному ДНК и будет связываться образую комплекс ДНК-РНК.
tracrRNA (Trans-activating crRNA) это тоже маленький участок РНК который необходим для созревания crRNA.
В итоге crRNA связывается, к примеру, с вирусным ДНК и этот комплекс распознаётся нуклеазой Cas9 и нуклеаза режет две нити вирусного ДНК рисунок ниже.
 |
| Image from NEB.com |
В лаборатории CRISPR/Cas9 система примерно также, только немного упрощена и нацелена на родной, клеточный ДНК. Первое что предприняли молекулярные биологи это срастили crRNA и tracrRNA и назвали этого гибрида как sgRNA (single guide RNA). И сейчас можно делать трансфекцию лишь одной плазмиды на которой уже будет ваш sgRNA и Cas9 и тем самым убирать любой участок ДНК в геноме клетки (как говориться производить нокаут) рисунок ниже.
 |
| Image from IDT.com |
Cas9 будет резать нужный вам геномный участок ДНК и это индуцирует механизм который называется Non-Homologous End Joining (NHEJ), в результате этого процесса небольшой участок ДНК где произошло разрезание будет отсутствовать (для лучшего понимания NHEJ советую посмотреть это видео https://www.youtube.com/watch?v=31stiofJjYw ). Также можно внедрить условно говоря любую ДНК последовательность, но для этого помимо всего то что было сказано выше нам понадобится трансфектировать ещё одну плазмиду, которая будет нести собственно ваш ДНК концы которого будут комплементарны концам разрезанного участка ДНК. При этом репарация ДНК пойдёт другим путём так называемым гомологичным сращиванием концов (homology directed repair, HDR https://www.youtube.com/watch?v=86JCMM5kb2A). Внедряют обычно последовательность которая будет либо понижат экспрессию вашего гена (внедрение stop sequence) или увеличивать (activation sequence) рисунок ниже.
Ещё одна особенность этой системы это то что на 3' конце противоположной нити ДНК должна находиться PAM (Protospacer adjacent motif) последовательность, Например для Cas9 из Streptococcus pyogenes PAM это NGG (N-любой нуклеотид). Без этой последовательности процесс невозможен. В помощь исследователям есть множество программ которые смогут найти для вас оптимальную последовательность содержащую PAM.
 |
| Image from NEB.com |
В целом можно сказать CRISPR/Cas9 система очень полезна для биологов, достаточно быстро можно "нокаутировать" мышей, например если брать механизм гомологичной рекомбинации то исследователи могут затратить в среднем 1-1.5 года на выведение одной линии нокаут мышей, когда как с использованием CRISPR/Cas9 это время сокращается до 6-7 месяцев.
Конечно также есть и свои трудности. Например существует вероятность off-target мутаций. Чтобы исправить этот недостаток существует метод введения двух sgRNA которые нацеливаются на один ген, тем самым вероятность ошибки падает значительно. Плюс можно и нужно проводить скрининг и тем самым избавляться от off-target мутаций (хотя скрининг достаточно трудоёмкое занятие).
 |
| Image from NEB.com |
Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23.
Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63.
Science. 2014 Nov 28;346(6213)
Комментариев нет:
Отправить комментарий