Конечно Mэйо клиника известная организация и попасть туда на резидентуру ооочень сложно и считается большим успехом для студентов медицинских школ, но блин это же в Миннесоте....:). Бригхам обычно в топ 10 но в этот раз лишь 13-ые. MGH как всегда на уровне, интересно сказывается ли то что одно из зданий этого госпиталя бывшая тюрьма?...:) Интересно что госпиталь Корнеля тоже в топе, кстати декан корнельской медицинской школы около 4 лет назад возглавлял нашу кафедру здесь в Бригхаме, потом его переманили в Корнель на позицию заведующего департaмента внутренних болезней, через пару лет уже декан, жизнь удалась!!!
Когда делал свой PhD, по каким-то причинам Университет в котором я учился перестал платить за бесплатный допуск к статьям в Pubmed. Это был сложный период так как одними абстрактами сыт не будешь. Думаю для любого исследователя нужно знать чем занимаются его коллеги, какие новые методы осваивают, какие новые направления нынче в тренде. Другими словами исследователям как никому нужно держать нос по ветру.
Я нашёл выход из этой ситуации тогда, я начал писать авторам (обычно последним) статьи, мол так и так у меня нет доступа к вашей статье не могли бы вы прислать мне ваши работы по почте (электронной). Все мне отвечали через несколько дней посылали мне свои статьи (хочу заметить что ни разу не было случая когда кто либо не отвечал или не хотел прислать мне статью).
В целом было интересное время.
Sci-Hub logo
Конечно там где я работаю сейчас таких проблем нет, но не значит что они исчезли, уверен у миллиона людей нет свободного допуска к pubmed, и что делать им? Плюс меня всегда раздражало такое положение вещей, объясню почему: 1) Так как мы все живём в цивилизованном мире, мне кажется что знания должны быть бесплатными и доступными для всех желающих познать их. 2) практически все исследования делаются за счёт государственных грантов, деньги государство получает в виде налогов с населения. Значит если брать глобально то мы должны отчитываться перед народом, а как условный Петя из Монтаны работающий на фабрике по производству дверных ручек узнает куда ушли его налоги? у него нет бесплатного PubMed? а у многих научных журналов стоит paywall. Понятно 99.9% Петям из Монтаны плевать какие исследования мы провели у себя в лаборатории, но в теории люди имеют право знать куда ушли их деньги.
Как-то на этой неделе общался со своим лаб-мэйтом, начали говорить о журналах о значении импакт фактора раньше и сейчас. Мой коллега высказал интересную мысль которая заключалась в том что импакт фактор сейчас не имеет значения, так как все статьи онлайн, и если твоя работа интересна то её по любому будут читать и цитировать. Я не отрицал силу того что сейчас все в электронном формате что более-менее уравнивает шансы чтения больших и маленьких изданий, только что бы контент был интересен публике. Но в тоже время я заметил что импакт факторы никуда не денутся так как это и есть природа человека "строить иерархии" от менее престижного к более высокому. Эта черта в нас заложена генетически и мы всегда и везде будем строить иерархии.
Александра Элбакян (photo from Wikipedia.org)
И как-то за этим разговором о журналах, он мне показал сайт где можно загрузить любую статью бесплатно обходя paywall и добавил что когда у него не было Гарвардского ID, он читал статьи из этого ресурса, добавив с хитрой улыбкой на лице что этот сайт разработан русскими, потом я конечно узнал что разработан он был Александрой Элбакян жительница Казахстана.
Сайт называется Sci-Hub и оказывается он навёл большой шорох в мире науки так-как им стали пользоваться миллионы людей по всему миру, что соответственно не могло взволновать научные издания, которые хотят получать денюжку за просмотры.
Если честно мне понравилась эта идея, идея создания ресурса статей с бесплатным доступом, это новое, за этим будущее. И этот сайт и есть решение тех проблем о которых я упоминал выше. Значит не я один задавался такими вопросами.
Конечно то что сделала Элбакян не легально, контент принадлежит журналам и использование его без разрешения это нарушение авторских прав. Но когда-то в Англии был человек, говорят бегал по лесу с луком и в зелёных лосинах, он нагло грабил богатых людей но раздавал награбленное бедным крестьянам. Его звали Робин-Гуд, говорят он вымышленный герой, но видимо народ так хотел увидеть кого-то кто борется с несправедливостью что создал Робин-Гуда в своих сказках. Да он грабил и это как 300 лет назад так и сейчас преступление, но если закон защищает воров, кому нужен такой закон?
Вот и Александра, увидев такую не справедливость, решила пойти напролом (надеюсь что именно такие идеи мотивировали ее, создать этот ресурс). Сейчас она не может раскрыть своего место положения так как на нее подало в суд одно крупное научное издание Elsevier. И такое положение вещей возмущает многих. Так как многие понимают кто прав а кто нет, не по закону но по зову сердца.
Думаю что в будущем все к этому придёт, бесплатный допуск для всех к научным работам, уже некоторые журналы идут по этому пути такие как например Plos, eLife. NIH несколько лет назад запустил ресурс PubMed Central (PMC) со свободным допуском для всех, руководствуясь идеей что если исследования сделаны за счёт NIH то они должны быть бесплатными. Так что по любому всё идёт к этому, и вот теперь вопрос, неужели такие журналы как Cell, Science хотят создать себе имидж "зажравшихся чиновников" в глазах учёных которые хорошо "сидят" и не хотят видеть перемены.
Как-то недавно делали эксперимент вместе с одним коллегой, и мне нужна была стерильная вода, работали за её лабораторным столом поэтому я не был в курсе что где лежит.
Наконец нахожу стерильную воду, хочу отлить немного себе а она: "Нет, это для работы с клетками." и даёт мне другую склянку на которой написано DEPC water, и говорит: "Вот возьми эту..."
Я недоумевающе посмотрел на неё и говорю эта вода содержит DEPC (собственно поэтому так и называется) и используется она для работы с РНК, так как этот химикат уничтожает РНКазу. Она заулыбалась и говорит: "Ой, я не знала, думала что это просто fancy brand name".
Я тоже засмеялся и говорю: "Оооо наверное в твоём студенчестве ты не готовила сама этот DEPC water, не тратила пол дня нa это дело."
И как говориться меня понесло :), сразу вспомнил как готовил гели для Вестерн Блота, как заливал TEMED и сразу же перемешивал, мы даже в лаборатории хвастались между собой у кого гель лучше получился, сейчас можно купить готовые гели разной концентрации в зависимости от того какой размер протеина.
Когда я закончил свой монолог она заключила для себя вслух: "Если у меня когда нибудь будет своя лаборатория, то я приглашу постдока который до этого работал в очень бедной лаборатории".
И вправду есть смысл в этих словах, ведь только лаборатории у которых нешибко с финансами могут позволить себе такое "удовольствие" как приготовление геля в ручную, практически всех буферов, помню в своём PhD мы даже PBS сами готовили, потом автоклавировали и работали с клетками. Сейчас практически любой буфер commercially available были бы только финансы. У нас в Гарварде даже есть сервис (конечно не бесплатный) где ты отдаёшь биопсии мышей (кусочек хвоста или уха) и они определят за тебя генотип мышки (нокаут, гетеро или wild type).
С одной стороны это хорошо, когда ты знаешь что делаешь и знаешь что откуда приходит и происходит, почему в этом растворе используют эту кислоту а не другую итд. Так как это даёт тебе возможность вычислить где-ты ошибся, если эксперимент не получился.
Но с другой стороны, лабораторным сотрудникам платят зарплату, конечно не миллионы но тем не менее, и многие профессора просто не хотят чтобы его исследовательская группа тратила пол-дня на приготовление пресловутого раствора, проще купить и потратить это время на сами эксперименты как у нас говорят "data generation".
Предыстория:
Вбиваем в поисковик pubmeda слово "cancer" и получаем статистику что в прошлом 2014 году - 151,475 а в 2013 году - 144,283 статей и все эти статьи имеют если не прямую то хотя бы косвенную принадлежность к исследованиям в области раковых новообразований. К примеру в 1990 (15 лет тому назад) было опубликовано всего лишь 53,193 научных работ, как говорится прогресс заметен невооружённым глазом. Параллельно этому NCI (National Cancer Institute) получает самый большой "кусок" из бюджета одобренный конгрессом США на финансирование NIH (National Institute of Health), отсюда и идёт такой огромный оборот научных работ в этой области по крайне мере в штатах. Чтобы там не говорили что наука это чуть ли не искусство, но в отличие от художника которому нужен всего лишь холст и краски, или перо и бумага то учёному помимо светлой головы нужна и техническая поддержка, микроскопы, ПЦР машины, инкубаторы для хранения клеток, отдельная база для выращивания и содержания животных ну одним словом много чего ему нужно.
Никто не говорит что это не правильно, рост онкологических больных растёт во всех развитых странах и к сожалению пока нет идеального препарата который бы полностью излечивал людей от этого недуга и в тоже время обладал-бы минимум побочных эффектов.
Но как говориться много не значит лучше, если вкладывать огромные суммы (а речь идёт действительно об огромных инвестициях которые исчисляются в миллиардах долларов со стороны правительства США и частного сектора) то априори это не означает что сразу найдётся лекарство от рака.
Amgen жалуется...
Ну ладно давайте немного оставим эту тему о нужде или не нужде открытия лекарства от рака, возможно ли это или нет?
А подойдём к этому вопросу с другой стороны...
Итак огромное количество статей публикуется каждый день где так или иначе исследуют молекулярные механизмы раковых клеток или тестируют потенциальные фармакологические агенты в борьбе с раковыми клетками.
В идеале механизм коммерциализации научного открытия идёт по следующему механизму. Профессор Х делает открытие, находит молекулу Z которая убивает и экспрессируется исключительно в раковых клетках. Своё открытие он конечно же публикует в условном Nature. Эта статья срабатывает как маячок для фармацевтических компаний которые занимаются разработкой фармакологических препаратов, компания приглашает профессора как консультанта, выписывая ему хороший чек, и начинают разработку препаратов который бы нацеливался на эту Z молекулу и тем самым убивал бы раковые клетки. Препарат синтезируют, оформляют патент и затем запускают клинические исследования. Конечно это "грубая" картина куда не вошли многие детали но примерно всё выглядит так (также хочу сказать что это не единственные механизм, в некоторых случаях сам профессор оформляет патент на своё открытие и тогда ему надо либо искать инвесторов либо продать свой патент).
image from pharma.bayer.com
И вот одна такая компания Amgen, до того как начать синтезировать фармакологические агенты, решила удостовериться и повторить опубликованные результаты.
К своему удивлению только в 6 из 53 статей (около 10%), которые были опубликованы в таких журналах как Science, Cell и Nature, сотрудники Amgen смогли повторить результаты. Дааа это был конечно же большой удар по репутации академии, конечно определённый процент невоспроизводимости будет всегда в силу использования реагентов из разных компаний или не детального опубликованного протокола, но не в таких же количествах.
Другая компания Bayer из 67 статей только в 14ти случаях смогла подтвердить результаты исследований.
Условно, можно сказать что из 31-го миллиарда $ который тратиться NIH на исследования, 28 тратиться непонятно на что, на результаты которые просто не возможно повторить, какой же там разговор о лекарствах?!
Воспроизводимость:
Проблема воспроизводимости результатов стоит и стояла очень остро. Учёные в погоне за славой или слишком веря в свои идеи готовы на обман и выдают окружающим то чего на самом деле нет. Также учёные могут стать жертвой артефактов, хотя опять таки это скорее всего результат одержимости к одной идеи, человек субъективен. Также имеет место просто человеческая ошибка, так например я помню как одна статья из Science была отозвана из-за того что студент в лаборатории постоянно использовал не тот реагент и поэтому получал такие "отличные" результаты. Студент ошибку признал и профессор сам отозвал свою статью.
Но в защиту тоже хочется сказать что не всегда учёные виновники не воспроизводимости, так например недавно было объявлено что состав микробиома кишечника животных купленных из разных компаний РАЗНЫЙ и тем самым это может влиять на конечный результат опытов.
Личности:
Как говорил Иосиф Виссарионович: "Кадры решают всё!"
Хорошего постдока, лаборанта, специалиста не так-то легко найти, найти такого который с большей вероятностью забудет когда день рождения его подруги, но наизусть знает протокол приготовления TBST buffer. Таких мало, таких найти очень сложно, а в фармацевтических компаниях их ещё меньше так как туда идут люди которым нужно лишь одно деньги, они могут вам говорить всё что угодно но во главе угла это деньги, так как других причин переходить из академии в сектор биоиндустрии объективно нет, в компаниях лучше платят работают от звонка до звонка, и им грубо говоря по барабану что дополнительное ополаскивание лучше делать каждые 2 часа а тут уже 6:00 вечера какой там ополаскивание. Важно сказать что в отличие от академии где рабочее время не строго нормировано (в большинстве лабораториях) так как всё подчинено его величеству эксперимент и постдок как и профессор вынуждены подбивать свои другие дела под этот процесс. А в индустрии всё более строго, работа с 9 до 6, за переработку никто платить не будет поэтому никто и не будет ради какого-то там ополаскивания оставаться до поздна. Так что говорить об одинаковом уровне профессионализма и посвящения всего себя экспериментам всё таки не совсем будет уместно.
Это как дать одни и те же ингредиенты разным поварам в лучшем случае, в худшем дать одни и те же ингредиенты "условному мне" и повару, блюда получатся разными.
Ревизор:
И вот в июле 2012 года (примерно годом ранее началась вся эта шумиха) молекулярный биолог в области рака Елизабет Йорнс (Elizabeth Iorns) основывает и возглавляет компанию под названием "Science Exchange". Эта компания создаёт сеть лабораторий (анонимов конечно), хочу заметить создает сеть но не лаборатории, которая будет воспроизводить результаты из тех или иных статей. Мишенями для проверки они выбрали одни из самых высоко цитируемых статей в области рака:
Image from http://news.sciencemag.org/biology/2015/06/feature-cancer-reproducibility-effort-faces-backlash
Эта компания не сборище каких-то волонтёров или борцов за правду (хотя уверен есть и такие) но за проделанную работу платят лабораториям, а им в свою очередь платят фармацевтические компании которые не желают разбираться что и как но хотят знать стоит ли вкладывать деньги в то или иное направление молекулярной биологии. Плюс Laura and John Arnold Foundation выделил грант на "Transparency Science" от которого они получили 1.3 миллиона $ дополнительно. Так что как бы там не обрамляли этот Science Exchange на самом деле это посредник и что-то мне подсказывает что дело не только в поиске истины (в чём и есть наверное основное предназначение науки).
Кстати журнал Plos One поклялся что опубликует в своём журнале результаты "проверки" какими-бы они не были. Последние штрихи:
Почему всё именно так, а не иначе? Почему исследователи публикуют результаты которые не действительны? Неужели наука собрала всех подлецов которые только сидят и подтасовывают результаты? И наверное самый важный вопрос зачем?
Ответов и причин к таким действиям множество... Я не думаю что в науке так и собрались все вруны и подлецы, не утверждаю что все честные как ангелы но и совсем плохих тоже единицы. От публикования каких-либо фантастических результатов миллион долларов не положишь себе в карман, как говориться было бы за что? Да опубликование в таких журналах как Cell увеличивает твои шансы на получение хорошего гранта от NIH в будущем, но в большей части эти средства на исследования.
А может всё дело в системе распределения грантов, ведь порой получишь ты грант или нет зависит от твоего p value меньше он 0.05 или нет. Если нет то данные твои неинтересны и в финансировании откажут, и это может привести к тому что лабораторию придётся закрыть и всё над чем ты трудился всю жизнь канет в небытие.
Получить финансирование очень сложно, при том что бюджет стал несоизмеримо мал по сравнению с количеством исследователей.
Поймите меня правильно, я не оправдываю обман, обман есть обман независимо чем он был мотивирован, но видя ситуацию изнутри приходишь к мнению что всё не так просто как кажется.
И тем не менее, есть те 10% которые делают разницу, и благодаря им, мы знаем о существовании онкогенов, о том что можно лечить рак с помощью иммунных клеток, были открыты эмбриональные стволовые клетки а затем индуцированные плюропотентные стволовые клетки и многое, многое другое что делает молекулярную биологию самую быстро развивающуюся область естествознания.
Нашёл эту статью недавно, хотя опубликовалась она ещё в 2000 году. Как-то просто задал себе такой "бредовый" вопрос, вот люди едят куриный суп практически всегда когда болеют, а каково влияние куриного супа на организм человека и на его иммунную систему в частности?
Когда я ещё маленький спрашивал маму: "а почему собственно куриный суп?" Ответ сначала был простым: "Полезно, ешь!". Через несколько лет объяснение уже было более детальным, курица легкоусвояемое и диетическое (малое количество насыщенных жиров) мясо, поэтому когда человек болеет ему нужна такая пища, чтобы не "напрягать" организм. Доводы мамы были резонными, даже когда простужен аппетита особо нет.
И вот спустя наверное чуть более 20 лет, я могу с уверенностью сказать что данными которыми обладают мои родители давно устарели и что недавние исследования открыли новые свойства куриного супа.
Барбара Реннард задала тот же самый вопрос но только примерно на 15 лет раньше меня, и подошла к этому крайне серьёзно.
В секции использованных реагентов и методов (Materials and Methods) она подробно описывает протокол или по кулинарному "рецепт" приготовления супа (по бабушкиному рецепту), в своих экспериментах она использует правильные контроли, например негативным контролем в её экспериментах служила кипячёная вода из под крана. Другими словами, эксперименты были спланированы хорошо.
Результаты:
Инкубация нейтрофилов с жидкой фазой (бульон) куриного супа значительно ингибировало хемотаксис активированных иммунных клеток. Нейтрофилы были стимулированы зимосаном - активный, про-воспалительный компонент дрожжей и fMLP (N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine)-также синтезированный бактериальный пептид обладающий сильным хемотактивным свойством на нейтрофилы.
Дальше для того чтобы определить какой именно компонент куриного супа обладает самым сильным ингибирующим свойством, часть бульона была взята до добавления того или иного компонента супа (например, до добавления овощей, картошки или куриного мяса). Также все ингредиенты были сварены отдельно (курица, картофель, лук, морковь итд). К сожалению выделить один единственный компонент не удалось, что скорее всего говорит о многостокомпонентности куриного супа и что смесь всех этих веществ имеет столь сильный эффект на способности нейтрофилов передвигаться.
Последний результат в этой статье просто гениальный, док. Реннард сравнила влияние полуфабрикатных куриных супов (купленных в местном магазине) на хемотаксис нейтрофилов и оказалось что далеко не все показали одинаковый эффект как свежеприготовленный суп но это наверное уже вопрос к производителям этих супов.
Обсуждение:
Статья конечно выделяется, скажем так, особенностью выбранной темы, вызывает наверное некоторое недоумение или иронию. Но ведь на самом деле едим куриный суп, за всех конечно не ручаюсь но всех кого знаю употребляют его во время простуды, да и в обычном состоянии тоже.
На счёт хемотаксиса нейтрофилов, его ингибирование это хорошо или плохо? Однозначного ответа нет, в борьбе с инфекцией нейтрофилы должны мигрировать из крови в очаг воспаления и/или инфекции чтобы уничтожить её, но неконтролируемый прилив нейтрофилов в ткани может привести к тому что иммунные клетки будут атаковать родную ткань что конечно же не желательно.
И кстати док. Реннард опубликовала эту работу в достаточно приличном журнале (7.4 impact factor) CHEST, достаточно уважаемый журнал среди пульмонологов.
В прошедший четверг, было наше заключительное собрание. Менторы и менти (учитель, ученик) должны были собраться и отметить окончание менторского цикла.
Если честно голова моя была занята совсем другими мыслями и заботами, я только что приехал из Денвера, участвовал в ежегодной конференции от American Thoracic Society (ATS) и сразу же после приезда был не простой разговор с моим науч руком, мы пишем грант, хотим подать 5 июня, так что времени мало. Но всё равно как говорится выкроил время или как говорят американцы "make time" и посетил это собрание. Собрание было не таким как в прошлом году, в прошлом году была BBQ party и во время этой вечеринки отметили окончание менторского цикла. Было весело, много народу, но по моему церемония окончания цикла была как-то размыта количеством людей которые приходили и поев уходили по своим делам и вообще большим шумом который стоял в помещении так как все разговаривали между собой и особо не следили что происходит на сцене. Поэтому в этот раз решили сделать всё более академичнее, пригласили профессоров которые рассказывали нам о важности менторства и о том как это нам всем может помочь в развитии профессиональной карьеры.
Было конечно интересно послушать но этой официальностью они (организаторы) просто "убили" праздник. После лекции, выступили два постдока которые участвовали в этом цикле и рассказали о своём опыте пребывания там, тоже выглядело всё это немного нелепо.
В конце раздали сертификаты и не большой банкет, во время банкета я разговорился с одним постдоком который решил перебраться в другую лабораторию так как где он сейчас работает всё очень плохо, финансирования нет, постдоки тихо тихо покидают тонущий корабль и он тоже вроде собрался не тонуть вместе с кораблём а искать другие варианты. Это вообще в конец убило во мне настроение праздника. Так как самое не приятное это когда наблюдаешь что что-то погибает и ты ничем не можешь помочь а лишь эгоистично думаешь про себя "слава богу, что не со мной".
А сертификат то выглядит неплохо :)
Каким выдался этот год.
В целом всё было интересно на первом этапе, мы не знали друг друга, знакомились, узнавали разговаривали на различные темы, к концу энтузиазма немного убавилось но мы все равно встречались спрашивали о делах, о том кто куда подал грант, получил или не получил, какие замечания. Один ментор сейчас активно ищет работу в индустриальном (частном) секторе, большинство из них это в целом люди разочаровавшиеся в науке как лёгкий способ достижения успеха, с нынешним финансированием и постоянно растущим количеством постдоков конкуренция обретает дикие формы. Вот и многие решают пойти по реке с меньшим сопротивлением, тем более там платят больше. Хотя если честно является ли частный сектор течением с меньшим сопротивлением, это конечно тоже вопрос. Я знаю двух знакомых которые решились на этот переход и оба разочаровались, не выдержали конкуренции, их выкинули за борт и они оба вернулись в лоно академии (так мы называем все университеты и научные центры которые в большей части спонсируются государственными грантами). Конечно существуют много других более успешных примеров, но успех нигде не даётся легко. Почему я завёл разговор о частном секторе, лишь потому что все наши разговоры так или иначе касаются этой темы.
Буду ли я участвовать в следующем менторском цикле? Скорее всего Да, всё таки работая в лаборатории где постоянно общаешься только с 4-5 людьми это не правильно. Встречать новых людей которые занимаются тем же самым что и я это всё таки полезно. И в моей жизни были самые не вероятные истории где как мне казалось что этого человека я больше не встречу никогда но на определённом этапе моей карьеры эти люди играли далеко не последнюю роль в "быть или не быть", так что кто знает, земля круглая и может ещё как-то пересекусь я с ними, но будет ли моя судьба зависеть от них или их от меня это конечно не известно, а может просто так где нибудь на конференции между симпозиумами поговорить о своём о научном...
В одном из своих поздних сообщении я рассказывал о пользе физических упражнений, и о потенциальном вовлечении миокинов в этот процесс (http://naukageek.blogspot.com/2014/12/blog-post_10.html). Конечно не надо быть "семь пядей во лбу" чтобы сказать что физкультура полезна для здоровья и кстати здоровья не только физического но и психологического. Физические нагрузки снимают стресс, отвлекают от повседневных забот и т.д.
Image from Nat Rev Rheumatol. 2015;11(2):86-97
Но всё таки есть и другая сторона физических нагрузок и эта сторона влияет на организм негативно. Так например, профессиональные атлеты во время интенсивной подготовки к олимпийским играм или другим важным соревнованиям подвержены инфекционным заболеваниям. В большей степени это результат истощения организма и иммунной системы.
Или другой пример, у участников марафона и триатлона измеряли содержание про-воспалительных цитокинов (TNF-a, IL-1) и липополисахарида (воспалительный компонент грамм-негативных бактерии, также известен как эндотоксин) до и после соревновании. Оказалось что уровень цитокинов и липополисахарида был значительно выше по окончанию соревновании. Что меня удивило так это увеличение липополисахарида (lipopolysaccharide, LPS) в крови, можно объяснить существование цитокинов так как при физических нагрузках мышцы и иммунные клетки могут синтезировать эти протеины. Но LPS это чужеродный агент и достаточно токсичен для организма, в лабораторных условиях исследователи используют инъекции LPS как воспалительный агент тем самым создавая модель сепсиса или эндотоксимии (конечно концентрацию которую используют в лабораториях в много раз выше). Потенциальное объяснение этому эффекту то что во время изнурительных физических нагрузках увеличивается проницаемость кишечного эпителия и таким путём в кровь попадают микроорганизмы которые незамедлительно уничтожаются лейкоцитами но при этом высвобождается тот самый LPS.
Когда-то давно наткнулся на одну научную статью (сейчас уже точно не помню год выпуска но где-то 1964, -65 года) где предлагали использовать истощающие физические нагрузки (например бег в колесе) как модель для сепсиса на животных, в той статье исследователи аргументировали что иммунная реакция животных на физические нагрузки практически идентична с клиническими случаями сепсиса у пациентов. Конечно эта модель так и не стала "основной" в изучении иммунных и молекулярных основ сепсиса но действительно очень много схожестей, параллелей в этих двух процессах.
микроРНК уже наверное у многих на слуху, однажды в 1993 году открыв этот новый тип РНК научные исследования только приумножают знания о них. Сейчас микроРНК вездесущ, множество статей говорят о вовлечении микроРНК в воспалительные, иммунные реакции, ещё больше работ описывают значение микроРНК в росте и развитии раковых клеток, кардиоваскулярных. нейрологических итд нарушениях.
Также известен и механизм по которому микроРНК действует, как говориться "to make long story short" механизм действия основан на эволюционной идентичности ядерных клеток, они терпеть не могут двухцепочный РНК, вот увидят хоть малюсенький, микроскопический участок двухспирального РНК так сразу уничтожают весь РНК, как говорится "казнить, нельзя помиловать!!!".
Но, всегда есть но, и это НО я услышал когда нас с лекцией навещал ни мало, ни много человек который собственно открыл эти микроРНК (Виктор Амброс).
После того как он прочёл свою часовую лекцию где я практически ничего не понял, т.к. сей господин работает с нематодами, а что я знаю про нематоды, ну паразит он и есть паразит...
И после окончания его выступления по закону жанра пошли Вопросы - Ответы. Ну и один учёный, видимо тоже не из последних в этой области, спросил: возможны ли другие пути с помощью которых микроРНК регулирует экспрессию РНК (и соответственно генов, соответственно фенотип клетки, её функциональность)?
И тут док. Амброс сказал то что я наверное единственное что понял и запомнил. А сказал он следующее: - Да возможны и скорее всего возможны так как они встречают эффект микроРНК который не может объяснить нынешний механизм их действия. Продолжая дальше он дал волю своему воображению и продолжил: -Например, нам неизвестна есть ли связь между микроРНК и пептидами. Ведь пептиды это очень маленькие последовательности аминокислот, и интересно было бы узнать может ли микроРНК или его предшественник кодировать эти самые короткие последовательности аминокислот.
И вот вчера, просматривая последний выпуск журнала Nature, я обнаружил следующую статью:
Все эксперименты в этой статье проделали на растениях, но как говориться "первый пошёл!".
Не так давно шли дискуссии о том нужно ли вводить "hawk eye" систему в наш РФПЛ (хоук ай это камера которая находится высоко над футбольным полем и двигается вперёд и назад по стальному тросу, тем самым можно делать вид сверху и наблюдать передвижение всей команды по полю а также очень полезная вещь в спорных ситуациях в помощь арбитрам, например пересёк мяч линию ворот или нет). И во время этой дискуссии один журналист спросил Станислава Черчесова (нынешний тренер московского Динамо): - Как вы относитесь к введению хоук ай ?
- Хоук Ай для Российской Премьер Лиги как полёт в космос.
Почему-то когда слушал лекцию Дэвида Вайсса из Emory University вспомнил именно это высказывание. И действительно я только, только разобрался с Cre-loxP системой а тут на тебе CRISPR/Cas9 ситема которая и удобнее и эффективнее (http://naukageek.blogspot.com/2014/06/tx-cre-lox-system.html). Как сказал один воротила силиконовой долины: Когда ты покупаешь компьютер, ты покупаешь вчерашний день.
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) это участок ДНК который найден во многих бактериях. CRISPR также называют "иммунитетом" бактерий. Дело в том что CRISPR в ассоциацией с нуклеазами такие как Cas9 могут защитить бактерию от вредных ему вирусов путём разрушения чужеродного ДНК.
В итоге получилась достаточно эффективная штука, которую можно использовать по разному как говорится кто на что горазд, CRISPR/Cas9 система может служить как терапевтический инструмент в лечении генетических заболеваний, скрининга целевых генов в развитии лекарств для лечения болезней которые сейчас не лечатся, ну и само собой CRISPR/Cas9 уже сейчас достаточно активно утилизируется в генной инженерии (например в выведение нокаут мышей, linage tracing мышей, conditional knockout мышей и кстати других млекопитающих такие как крысы, вы не задавались вопросом почему столько нокаут мышей и очень редко кто работает или выводит нокаут крыс? Ответ на поверхности что легче то и выводят).
Как же это работает:
Давайте сначала посмотрим как CRISPR/Cas9 система работает в природе. Для того чтобы этот механизм работал без сбоев, требуются три компонента Cas9, crRNA и tracrRNA. Cas9 как уже упоминалось это нуклеаза которая собственно и будет резать чужеродный ДНК, но вопрос а почему Cas9, а не -8 или -5? Да существуют и другие нуклеазы, но в биотехнологии используется в основном CRISPR механизм 2-го типа и в нём участвует только Cas9, 2-ой тип это наиболее изученный и наиболее оптимальный, и достаточно простой механизм. crRNA (CRISPR-RNA) это собственно тот самый РНК (20 нуклеотидов) который комплементарен чужеродному ДНК и будет связываться образую комплекс ДНК-РНК. tracrRNA (Trans-activating crRNA) это тоже маленький участок РНК который необходим для созревания crRNA.
В итоге crRNA связывается, к примеру, с вирусным ДНК и этот комплекс распознаётся нуклеазой Cas9 и нуклеаза режет две нити вирусного ДНК рисунок ниже.
Image from NEB.com
В лаборатории CRISPR/Cas9 система примерно также, только немного упрощена и нацелена на родной, клеточный ДНК. Первое что предприняли молекулярные биологи это срастили crRNA и tracrRNA и назвали этого гибрида как sgRNA (single guide RNA). И сейчас можно делать трансфекцию лишь одной плазмиды на которой уже будет ваш sgRNA и Cas9 и тем самым убирать любой участок ДНК в геноме клетки (как говориться производить нокаут) рисунок ниже.
Image from IDT.com
Cas9 будет резать нужный вам геномный участок ДНК и это индуцирует механизм который называется Non-Homologous End Joining (NHEJ), в результате этого процесса небольшой участок ДНК где произошло разрезание будет отсутствовать (для лучшего понимания NHEJ советую посмотреть это видео https://www.youtube.com/watch?v=31stiofJjYw ). Также можно внедрить условно говоря любую ДНК последовательность, но для этого помимо всего то что было сказано выше нам понадобится трансфектировать ещё одну плазмиду, которая будет нести собственно ваш ДНК концы которого будут комплементарны концам разрезанного участка ДНК. При этом репарация ДНК пойдёт другим путём так называемым гомологичным сращиванием концов (homology directed repair, HDR https://www.youtube.com/watch?v=86JCMM5kb2A). Внедряют обычно последовательность которая будет либо понижат экспрессию вашего гена (внедрение stop sequence) или увеличивать (activation sequence) рисунок ниже.
Ещё одна особенность этой системы это то что на 3' конце противоположной нити ДНК должна находиться PAM (Protospacer adjacent motif) последовательность, Например для Cas9 из Streptococcus pyogenesPAM это NGG (N-любой нуклеотид). Без этой последовательности процесс невозможен. В помощь исследователям есть множество программ которые смогут найти для вас оптимальную последовательность содержащую PAM.
Image from NEB.com
В целом можно сказать CRISPR/Cas9 система очень полезна для биологов, достаточно быстро можно "нокаутировать" мышей, например если брать механизм гомологичной рекомбинации то исследователи могут затратить в среднем 1-1.5 года на выведение одной линии нокаут мышей, когда как с использованием CRISPR/Cas9 это время сокращается до 6-7 месяцев.
Конечно также есть и свои трудности. Например существует вероятность off-target мутаций. Чтобы исправить этот недостаток существует метод введения двух sgRNA которые нацеливаются на один ген, тем самым вероятность ошибки падает значительно. Плюс можно и нужно проводить скрининг и тем самым избавляться от off-target мутаций (хотя скрининг достаточно трудоёмкое занятие).
Image from NEB.com
Литература:
Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23.
Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63.
Ходим ли мы по кругу или всё таки делаем какой-то прогресс?
Все то что мы нашли будет ли полезно или всё таки это так и останется на бумаге? Какова значимость тех или иных открытий, опубликование в Science или Nature это знак качества?
Или может я как исследовательская единица смотрю на все происходящее со "своей колокольни"? Если честно я не верю в то что внедрение одного цитокина или его нейтрализация может излечить человека от сепсиса, я перестал в это верить когда все антитела которые были нацелены на обезвреживание цитокинов провалились в клинических испытаниях, понимаете ни один, ни два а все. (http://naukageek.blogspot.com/2014/11/blog-post_13.html)
Но может быть я не прав? Может быть просто нацеливались не на те цитокины, не так подобрали антитела, а может ещё что: неправильное дозирование, время лечения?
Так вот 13 марта этого года вышла статья где говориться об интерлейкине-3 (ИЛ-3) как потенциальная цель в лечении сепсиса.
Я хотел бы для начала поговорить о профессоре в лаборатории которого сие открытие сделано.
Филип Свирски, на мой взгляд очень талантливый учёный, достаточно молодой (на мой взгляд может немного за 40), знаете такой высокий мужчина, статный, в очках и с таким очаровательным британским акцентом,работает он в MGH (Massachusetts General Hospital) это относительно недалеко от того места где я работаю. Так что он часто даёт лекции в нашем госпитале, тем более ему есть что сказать. Когда я впервые послушал его лекцию, меня как-будто обдул свежий ветер, ветер нового поколения исследователей, мотивированных, собранных, точно знающих то что они хотят и результаты его были очень интересные.
Изначально док Свирски не занимался сепсисом, он достаточно успешно трудился в области атеросклероза и других кардиоваскулярных заболеваний. Изучал он влияние иммунной системы, а в частности влияние различных типов моноцитов в развитие атеросклероза. Большое внимание он уделял селезёнке, утверждая что это чуть ли не краеугольный камень в формировании атеромы. Хотя очень старое эпидемиологическое исследование (исследовали солдат второй мировой войны которые подверглись спленоктомии, и документировали какова частота заболевания кардиоваскулярными болезнями, в итоге оказалось что ветераны со спленоктомией были более подвержены сердечно сосудистым заболеваниям) шло вразрез его современным исследованиям.
И вот в 2012 году он публикует, не то чтобы интересную, но в определённой степени инновационную работу где характеризует новый тип В-лимфоцитов и называет их как Innate Response Activator B cells (журнал Science). В этой работе его лаборатория утверждает что эти клетки нужны для защиты организма от патогенных микробов, эти IRA B клетки имеют уникальную способность продуцировать GM-CSF (granulocyte monocyte - colony stimulating factor) который в свою очередь показал потенциальную терапевтическую принадлежность в лечении сепсиса. Самые наверное "striking" результаты были когда они вывели IRA B cell дефицитные животных и наравне с нормальными мышами подвергли их сепсису, 40% выживших наблюдалось в контроле когда как в дефицитных мышах 0%, все мыши погибли в течении 2 дней. Те кто хоть раз пробовал сделать эту модель экспериментального сепсиса, я думаю оценят это действительно яркий фенотип говорящий о важности этой популяции клеток.
Через 3 года, то бишь в 2015, лаборатория Свирски публикует ещё одну работу о сепсисе (наверное R01 получил :) ), и в этой работе он исследует один цитокин ИЛ-3. ИЛ-3 это плейотропный протеин который участвует в пролиферации и дифференциации различных клеток костного мозга, миелоидных и лимфоидных популяции. Они также идентифицировали что ИЛ-3 это ведущая сила в мобилизации про-воспалительной реакции иммунной системы которая ведёт к нарушению функции органов и соответственно к смерти. И логически если блокировать ИЛ-3 то воспалительная реакция более слабая, меньше циркулирующих моноцитов и нейтрофилов, меньше негативного влияния на органы жизнедеятельности что в итоге приводит к выживанию. В добавок, в подтверждение своих экспериментов, группа Свирски нашла корреляцию между концентрации ИЛ-3 в крови септических пациентов, чем выше тем прогноз хуже.
Данные конечно интересные и заслуживают внимания, но почему-то прочитав эту статью я не мог отделаться от мысли что эта история очень похожа на историю с TNF-a и все мы прекрасно знаем чем всё это в итоге закончилось.
Теоретическая физика утверждает что есть возможность летать во времени, но нет устройства который бы был способен на это. Раз сел в эту машину времени, и улетел на 20 лет назад, захотел и на 30 лет вперёд, вот весело будем жить. Но нет такой машины, много что есть, господа учёные много что смастерили и атомную бомбу, и в космос летаем как на Таити олигархи. Много что такого мы изобрели, и биологи тоже многим могут похвастаться, биологи тоже сложа руки не сидели, тоже работали днями и ночами и результаты у них тоже впечатляющие.
Но есть вещи которые неоспоримы такие как жизнь и смерть. Даже философы (какие уж там биологи) считают что жизнь не отделима от смерти, что жизнь это своего рода смерть и наоборот. А ещё считают что жизнь любого живого существа это билет в один конец, родился значит когда нибудь умрёт другого пути нет. А почему так считают? Так потому что никто ещё не вырывался из лап смерти попав туда, вот поэтому и суждение такое.
Биологи всем этим суждениям не противоречат, кто-то скажет что жизнь это билет в один конец, биологи лишь кивают мол да согласны. А в лабораториях своих эксперименты делают свои мысли при себе держат лишь только лабораторный персонал знает что к чему и всё на этом. Биологи же не философы, они свои работы не на своих мыслях строят, а на результатах экспериментов и наблюдений.
И ещё одна черта, не берутся господа биологи сразу за такой большой вопрос о жизни и смерти как философы, поступательно биологи действуют кирпичик за кирпичиком, болтик за болтиком, и иногда жизни не хватает чтобы полную картину создать того что задумал, но и здесь нашли они выход, тренируют биологи учёные себе подобных, мыслями своими своих учеников заражают, как грипп воздушно-капельным путём, чтобы после их смерти продолжили ученики дело учителя. Работает система, хорошо работает.
Так и смерть разобрали на составляющие, и сейчас запрограммированная клеточная смерть апоптозом называется. Процесс апоптоз условно можно поделить на четыре фазы: инициация, усиление, исполнение и смерть. И догма молекулярной биологии заключается в том что если клетка входит в фазу исполнения то обратного пути нет.
Самыми важными молекулами в этом процессе считаются каспазы (протеины исполнители), пик активности каспаз приходит соответственно на фазу исполнения. Каспазы участвуют во фрагментации ДНК и в разрушении протеинов которые жизненно необходимы для клетки. Догма апоптоза заключается в том что с активизацией каспаз процесс становится необратимым.
Но есть такой учёный Дениз Монтел (Denise Montell) которая взяла и подставила под сомнение эту догму. Дело в том что точка невозврата у всех разная, у каждого типа клеток он свой, также многое зависит от индуктора апоптоза, его концентрации и продолжительности инкубации. Док. Монтелл и её коллеги из Калифорнийского Университета в Санта Барбара задались простыми вопросами а где эта последняя черта невозврата? Является ли активизация каспаз тем самым водоразделом между жизнью и смертью клетки?
Чтобы ответить на эти вопросы, они индуцировали апоптоз и инкубировали до того момента пока не появятся явные морфологические и молекулярные признаки смерти клетки такие как уменьшение размеров клетки, фрагментация ДНК и активизация каспаз. После этого клетки были промыты физиологическим раствором и инкубировались без индуктора апоптоза. Парадоксально, но клетки вместо того чтобы умереть, восстановились после стресса и продолжали дальше расти (видео обратимости апоптоза: https://www.youtube.com/watch?v=CkHC6BlrbAM ).
Исследователи проверили этот эффект на разных клеточных линиях включая свеже-изолированные клетки такие как фибробласты, гепатоциты, раковые клетки и макрофаги. Соответственно, индуцировали апоптоз различными агентами фибробласты диметилсульфоксидом, гепатоциты этанолом и т.д. И несмотря на разные клеточные культуры и различные индукторы эффект обратимости исполнительной фазы апоптоза был задокументирован во всех случаях, говоря об универсальности механизма восстановления клетки как и универсальность апоптоза. Процесс обратимости запрограммированной смерти клетки был назван анастаз"anastasis"(что с греческого переводится как "возрождение", "подъём") в противовес апоптозу (что с греческого означает "падение"). В этой работе исследователи также анализировали ДНК "анастазированных" клеток найдя в них различные хромосомные аномалии которые часто встречаются в раковых клетках.
Насколько мне известно работа док. Монтелл которую я описал является пока единственной в этой области. Дальнейшие исследования этого процесса имеют хорошую перспективу в изучении онкологических новообразований. Является ли анастаз эволюционным механизмом адаптации раковых клеток к химио- или радиотерапии? Ведь как известно если рак "возвращается" после курса терапии то болезнь обретает более агрессивный характер с большей толерантностью к препаратам. Какова роль анастаза в нейродегенеративных расстройствах, в сердечно сосудистых заболеваниях? Все эти вопросы пока открыты.
Тихо но верно PubMed становится Facebook(ом), хорошо ли это или плохо я честно сказать не знаю, наверное не очень хорошо и скорее всего этого не будет.
И вот я серфю по просторам Pubmed, не имея конкретной цели, просто просматриваю последние статьи, с ординарным вопросом в голове: что новенького случилось?
Не знал что оказывается в Pubmed можно оставлять комментарии к любой статье, надо просто завести аккаунт. Никто конечно себя не утруждает писать комменты к статьям, по крайне мере я ни разу не видел этих комментарий, но тут аж целых 7 комментов причём тысяч по 3 слов в каждом, вот млин не поленились труженики науки отписали чтобы на сердце легче стало, пар выпустить.
А статья с безобидным названием: Variation in cancer risk among tissues can be explained by the number of stem cell divisions.
Первый автор задался простым и в эти дни даже банальным вопросом какой процент онкологических заболеваний происходят из-за внешних факторов (плохая экология, плохие привычки т.к. курение, алкоголь) и какой процент из-за генетических факторов (врождённые мутации)? Чтобы ответить на первый вопрос надо сначала ответить на другой вопрос, а каков процент раковых заболеваний случайны, инцидент которых происходит не из-за плохих внешних факторах и не из-за "плохих" генов. За основу исследователь взял уровень деления клеток. Деление клеток очень сложный молекулярный процесс в который вовлечено сотни генов, даже не совсем умному человеку ясно что чем сложнее механизм тем больше вероятность ошибки, поэтому и в клетке существуют различные "страховочные" рычаги которые могут к примеру определить уровень ошибки в репликации ДНК и если уровень высокий то деление приостанавливается запуская механизмы починки ДНК, но тем не менее "поломки" случаются. А раз есть вероятность ошибки, значит есть вероятность случайных мутаций которые в итоге могут привести к раку.
Вот и исследователь задал этот вопрос и получил достаточно интересные результаты. Сравнивая количество и частоту деления стволовых клеток в различных органах с инцидентом онкологических новообразований, док. Томазетти нашёл тесную положительную корреляцию.
Так к примеру, авторы статьи объясняют почему рак толстого кишечника наиболее часто встречается чем рак двенадцатиперстной кишки. Дело в том что в толстом кишечнике в течении жизни происходит примерно
1012 делений стволовых клеток когда как в двенадцатиперстной кишке их всего лишь около
1010.
Что же это такое? Если говорить простым языком то результаты говорят о следующем, что существует вероятность ошибки при делении клетки, чем чаще клетки ткани делятся тем вероятность больше что дочерняя клетка может пойти "левым" путём развития и в итоге приведёт к раку и даже если вы будете невинным как Будда, ни пить, ни курить и иметь супер здоровые гены то это не означает по умолчанию что вы не заболеете этим страшным недугом просто вам не повезло.
А вообще, интересно то что с этой статьёй вводится 3-ий фактор или вернее попытка введения этого фактора. Помимо внешних факторов включая плохие привычки и врождённых мутаций эта статья заявляет о третьем факторе случайности который может влиять независимо от двух других. Является ли этот фактор какой-то системой о которой мы пока не знаем, или это действительно стохастический фактор? Каков процент этой случайности? На эти вопросы авторы ответа не дают.
Если вам задать вопрос с какими именами у вас ассоциируются исследования в области стволовых клеток?
То скорее всего первое что придёт на ум это Шинья Яманака, Хван У Сук (хоть и не в самом лучшем свете) или Эванс и Кауфман (Нобелевские Лауреаты, за открытие эмбриональных стволовых клеток).
Но наверное мало кто знает о таком исследователе как доктор Миталипов.
Да, да тоже наш соотечественник, может быть не так популярен как Яманака со своими индуцированными плюропотентными клетками (iPS), но именно клетки Миталипова могут быть потенциальными "конкурентами" iPS клеток если здесь вообще употребительно слово конкуренция.
В чём же заключается главное открытие Шухрата Миталипова, после которого он стал популярен не только в области стволовых клеток но в биологии в целом.
Здесь нам надо будет уйти немного в прошлое, а вернее во времена овечки Долли, первого животного которого смогли клонировать. Клонирование это очень "широкое" слово, оно может использоваться в генетике говоря к примеру: "я клонировал Х ген" что может означать что человек сумел внедрить последовательность ДНК которая кодирует Х ген в плазмиду (вектор).
В области же стволовых клеток клонирование это техника переноса ядра из соматической клетки в яйцеклетку у которой её собственное ядро удалено. Также эта техника называется как пересадка ядра соматической клетки, Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT). Благодаря этому SCNT была клонирована овечка Долли (1996 г) вот было шумихи тогда, все сразу заговорили о клонировании человека, о том что богатые теперь будут жить по 200 лет так как будут клонировать себе подобных и брать их органы себе в пользование, что только не говорили.
Но тут была проблема, многие не могли создать человеческие стволовые клетки путём SCNT. Первый кто это сделал, вернее сказал что сделал, был Хван У Сук, корейский исследователь из Сеульского Национального Университета. Но потом оказалось что его результаты сфабрикованы, никаких человеческих стволовых клеток и в помине не было. После такого скандала пошла обратная волна, да кому это нужно? это невозможно в принципе! и тд и тп.
А доктор Миталипов был верен себе, и в 2007 году он публикует свою работу в Human Reproduction (не самый известный журнал в мире) где заявляет что его команда может создать стволовые клетки путём SCNT используя клетки макаки. А уже 2013 году, его метод срабатывает и с человеческим материалом, эту работу он уже публикует в Cell (один из самых известных журналов в мире). И самое главное, его результаты смогли повторить другие лаборатории в отличии от корейского коллеги.
Кофе на утро, не так уж и плохо.....
Говоря простым языком, а в чём фишка? Почему сотни людей пытались и не смогли а он тут пришёл и смог? Он что дует на эти клетки как-то по-особенному?
Нет никакой мистики, всё достаточно просто.
В процессе SCNT много этапов, один из самых сложных это этап удаления ядра из яйцеклетки. Удаление производят когда яйцеклетка находится в метафазе II, было уже давно известно что обезъядервание ведёт к нарушению репрограммирования клетки в следующих процессах когда вводят ядро из соматической клетки. Причины этого нарушения точно не известны, считается что обезъядервание ведёт к активизации других органелл таких как митохондрии, неправильном функционировании транскрипции РНК и другие причины.
Группа Миталипова поступила следующим образом, во время обезъядервания клетки находились в 1.25 mM растворе кофеина, ингибитор фосфодиэстеразы.
И это сработало!!! добавление кофеина увеличило формирование бластоцист до впечатляющего уровня 71%. Точный механизм действия кофеина не ясен, но очевидно то что он стабилизирует яйцеклетку в метафазе II и тем самым делает возможным последующие операции с переносом соматического ядра.
Исследователи гипотезируют что кофеин как ингибитор фосфатазы, блокирует процессы которые активизируются при удалении родного ядра что по умолчанию блокирует активизацию самой яйцеклетки и её органелл.
Так что сейчас можно поставить эмбриональные стволовые клетки, iPS клетки и клетки выведенные группой док. Миталипова так называемые ntES клетки (nuclear transfer Embryonic Stem cells) в один ряд!
P.S. Казахская сторона пишет об успешном казахском учёном в штатах. Российские сайты пишут о выдающемся российском исследователе. Уйгурская община в Казахстане гордится своим сыном.
Судите сами, родился он в Казахстане, по национальности уйгур, докторскую степень получил в Москве (а всё это когда-то было СССР) и наверное самый значительный научный вклад сделал в Соединенных Штатах.
Циркадный, что с латинского означает circa — около, кругом и dies — день, это 24-х часовой биологический ритм который прослеживается во многих организмах начиная с растений и бактерий заканчивая млекопитающими включая Homo sapiens. Несмотря на это мы очень мало знаем о физиологии этого жизненно важного для нас свойства, из чего этот ритм происходит? как он регулируется? насколько велико его влияние на наше с вами здоровье? Все эти вопросы в большей степени, в течении долгого времени оставались и отчасти остаются для нас неизвестными.
Жизнь зародилась около 3 миллиардов лет тому назад, значит до сих пор произошло около триллиона восходов и закатов звезды по имени солнце. Вы представляете?! ни кино, ни книг вообще ничего, только вечно бурлящий, протеиновый бульон на нашей планете и восходы, закаты, восходы, закаты..... Другими словами это очень сильно повлияло на наше с вами теперешнее состояние в ходе эволюции.
Важность:
Человек в среднем тратит 36% из своих 24 часов в сутки на сон и уменьшение количества часов на отдых может привести к плачевным последствиям. Уже установившийся факт что количество дорожных инцидентов диспропорционально высоко на 03:00 утра по сравнению с любым другим временем суток, также не случайность и то что различные катастрофы огромных масштабов такие как авария на чернобыльской АЭС случилось именно в ночную смену.
Расстройство циркадного ритма сна или бессонница наблюдается у 80% людей с шизофренией и хронической депрессией. Также в 2007 году международное агентство по изучению рака классифицировало работу в ночную смену как потенциально канцерогенный фактор. В частности, эпидемиологические исследования нашли тесную корреляцию между работницами в ночную смену и инцидентом заболевания раком молочной железы.
Все эти наблюдения говорят лишь о том что нарушение циркадного ритма влияет на наше здоровье в значительной степени.
Механизм:
Циркадные ритмы подвержены многочисленным внешним факторам, один из самых главных факторов это дневной свет. Свет детектируется органами зрения и сигнал передаётся через ретино-гипоталамический тракт к нейронам супрахиазматического ядра (СХЯ) в гипоталамусе. СХЯ является центром наших биологических часов и посредством различных нейро-физиологических процессов активизирует симпатическую нервную систему которая влияет на активность и функциональность внутренних органов организма (Рисунок 1).
Но если подойти к биологическим часам со стороны генетики, то долгое время оставалось неизвестным какие гены несут ответственность за реализацию циркадных ритмов.
Первый ген который имел отношение к циркадным ритмам был клонирован у дрозофилы в 1984 году, это был "Per" ген (ниже будет описана функция этого и других генов в регулировании биологических часов) и только через 10 лет (в 1994 г) были в первые выведены мыши с мутированным циркадным геном "CLOCK".
На сегодняшний момент известно 20 генов которые напрямую влияют и играют важную роль в циркадных ритмах (их количество продолжает расти).
С молекулярной стороны, циркадный ритмы можно назвать как транскрипторно-трансляционная негативная петля (Рисунок 2). Х протеины активизируют транскрипцию РНК Y генов из которых транслируются Y протеины, эти белки регулируют циркадный цикл и в тоже время ингибируют функцию Х протеинов. В дальнейшем, Y протеины деградируются благодаря протеосом и круговорот начинается заново.
Циркадный цикл начинается с экспрессии двух протеинов Bmal1 (brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT)-like 1; также известный как ARNTL) и CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput). Эти два протеина связываются друг с другом образуя гетеродимер. Этот комплекс в дальнейшем транслоцируется в клеточное ядро и действует как активатор транскрипции различных генов так называемых "часовых генов" (clock genes) которые отвечают за колебания активности различных параметров жизнедеятельности организма начиная с метаболизма липид в печени, артериального давления заканчивая способностью мозга к мыслительным процессам. Помимо активизации clock genes, Bmal1-CLOCK комплекс активизирует транскрипцию двух циркадных генов Per (period circadian protein) и CRY (cryptochrome), эти два протеина также димеризуются и транслоцируются в клеточное ядро где ингибируют Bmal1-CLOCK комплекс, в течении сна Per-CRY комплекс деградируется и Bmal1-CLOCK гетеродимер обратно активизируется и начинает новый цикл, всё это происходит в течении 24 часов (Рисунок 3). Примерно 10% от всего генома человека находится под непосредственным контролем циркадного ритма.
Влияние циркадных ритмов на иммунную систему:
Несмотря на то что циркадный ген нокаут мыши появились только в 1994 году, первые исследования в которых учёные пытались найти связь между циркадными ритмами и иммунным ответом были проделаны ещё в 1960-м году.
Начнём с того что в нашем организме в течении 24 часов происходят колебания уровня лейкоцитов в крови и в тканях, пик циркулирующих лейкоцитов приходится на фазу отдыха (у людей это ночь, у мышей день), когда как максимум лейкоцитов инфильтрирующие в ткани происходит в первых часах активной фазы.
Исходя из этих колебаний , исследователи наблюдали что повышенная летальность у мышей происходит если вводить бактерии или их токсичные компоненты (липополисахарид) перед началом активной фазы. Это результат повышенной миграции лейкоцитов в ткани животных которые при активизации выделяют воспалительные цитокины и повреждают родную ткань что приводит к высокой смертности.
Также интересные результаты были получены в 2008 году при сравнении имунного ответа мышей во время сепсиса при исскуственном нарушении циркадного ритма (постоянная темнота или постоянный свет). Выживаемость во время экспериментальной модели сепсиса была намного хуже у мышей которые были подверженны постоянному свету или постоянной темноте в сравнении с нормальным 12 часовым циклом света и темноты.
ZT аббревиатура от Zeitgeber с немецкого переводится как таймер. ZT это внешние условия которые синхронизируют внутренний ритм мышей на 24-х часовой день-ночь цикл. Чаще всего используется искусственный 12 часовой цикл света и темноты.
С выведением нокаут линий количество знаний о влиянии циркадных генов на иммунные клетки увеличилось значительно. Так например, стало ясно что Bmal1 является противовоспалительным протеином так как Bmal1 нокаут макрофаги экспрессировали больше воспалительных медиаторов (цитокинов и хемокинов) по сравнению с контролем во время имунного ответа на липополисахарид. С другой стороны CLOCK протеин имеет способность связываться с транскрипторным фактором NF-kappaB и тем самым усиливать его транскрипторную активность что приводит к увеличению синтеза воспалительных протеинов. Тем самым CLOCK нокаут клетки показывали пониженное содержание цитокинов в ответ на воспалительный стимул.
Будущие задачи:
Несмотря на то что за последнее десятилетие, изучение циркадных ритмов с позиции молекулярного механизма продвинулись достаточно далеко многие вопросы до сих остаются для нас не известными, Мы пока не знаем клеточную специфичность циркадных генов? Какова роль циркадных ритмов в поддержании гомеостаза иммунной системы?
Также интересно будет узнать есть ли корреляция и/или взаимосвязь между циркадными ритмами и фармакодинамикой лекарств. Должны ли фармакологи изменить приём введения лекарства основываясь на этих ритмах и экспрессии соответствующих генов чтобы усилить эффект уже существующих препаратов? Все эти вопросы пока, остаются открытыми.
Литература:
Sleep Med Rev. 2013 Dec;17(6):433-44.
Breast Cancer Res Treat. 2013 Feb;138(1):291-301
Cancer Causes & Control January 2015, Volume 26, Issue 1, pp 143-150
Exp Physiol 99.4 (2014) pp 599–606
Immunity. 2014 Feb 20;40(2):178-86
Знаете когда ведёшь блог ты можешь вести статистику посещений, из каких стран, по каким темам люди заходят на твой блог. А ещё в инструментах блога есть такая графа результаты поиска (допустим условный Ваня хочет знать что такое воспаление и вбивает в поисковик google слова "воспаление это" или " воспаление определение") и после нажатия клавиши Enter выходит список релевантных ссылок. Так вот относительно недавно в этой графе я увидел "постдок это" и "постдок в США", значит кто-то хотел найти информацию о постдоке и кликнул на одну из моих статей посвящённые постдокам. Честно говоря мне было не по себе, так как хоть мои некоторые статьи и несут слово постдок но это в большей степени какие-то мои размышления о постдоках или личное мнение на происходящее вокруг меня, так что считаю что мои статьи хоть и о постдоках но особой информации не несут, представляю человек зашёл по ссылке а там "фигня" какая-то, сам не люблю когда так происходит со мной.
Поэтому я бросил написание важной темы о циркадных циклах и воспаление :) и пишу это сообщение :).
Самое релевантное определение я нашёл на вебсайте "National PostDoctoral Association" -
A postdoctoral scholar ("postdoc") is an individual holding a doctoral degree who is engaged in a temporary period of mentored research and/or scholarly training for the purpose of acquiring the professional skills needed to pursue a career path of his or her choosing. Ссылка: http://www.nationalpostdoc.org/policy-22/what-is-a-postdoc
Сами понимаете постдок это сокращённо от постдокторал "после докторской", в переводе это определение звучит следующим образом, постдоковский стипендиат это человек имеющий докторскую степень который временно вовлечён в исследовательскую деятельность или/и какой нибудь другой тренинг для приобретения определённых, профессиональных навыков которые нужны ему/ей для продвижения своей карьеры под руководством ментора.
Во-первых человек должен обладать докторской степенью, в штатах как и в целом на западе система образования немного другая. Если брать научную сферу то PhD (Doctor of Philosophy) это высшая научная степень которая возможна, в нашем же пост-советском мире существует Кандидатская и Докторская Степень, к счастью для нас всех, кандидат наук приравнивается к PhD holder, так что люди защитившие кандидатскую степень могут смело искать постдок в любой точке земного шара включая США.
Но как вы заметили было написано doctoral degree (докторская степень) и это не означает только PhD но также включает в себя MD (medical doctor), DMD (doctor of dental medicine), DVM (doctor of veterenary medicine), или другая степень которая именуется общим названием как Advanced Degree другими словами вам не обязательно быть кандидатом наук, люди которые окончили мед. институты, те кто учились на ветеренаров или стоматологов могут также искать постдок их степени также релевантны как и кандидат наук.
Почему так? всё опять упирается в разницы образования у нас после школы люди поступают на медиков, дантистов и тд, в штатах же после школы люди идут в колледж (undergraduate) они могут пойти по любой специальности от искусства до математики после окончания ты получаешь диплом от колледжа и после этого ты можешь поступать в медицинскую, ветеринарную и другие школы и это уже graduate, люди окончившие эту школу имеют степень MD, DVM итд и могут идти на постдок, хотя понятно что никто этого не делает, человек в штатах имея MD с условным зароботком 90К в год не будет работать постдоком с заработком реальными 45К, только если это нереально "помешанный" на науке чел ну или кто-то из заграницы и его МD не имеет легитимности, не имеет права практиковать в клинике не сдав соответствующие экзамены. Тоже самое касается и ветеринаров, и стоматологов если хотите работать по профессии надо сдавать экзамены. Я заметил что многие (те кто окончил MD заграницей) выбирают следующую стратегию, они приезжают на постдок в штаты работают, заводят связи, и одновременно готовятся к экзаменам, сдают их и потом начинают поиск резидентуры используя те связи которые уже человек наладил во время своего постдока. Только вы не подумайте что связи в плане кто-то кого-то проталкивает, хотя чёрт его знает может и такое имеет место быть но я с этим не встречался и не слышал про такие случаи, использование связей я имею ввиду рекомендательные письма которые как я слышал играют большую роль в поиске резидентуры, ну например круто же получить рекомендательное письмо от Chief of Pulmonary Division in Harvard Medical School? Верно же? Такая кандидатура наверное будет априори более конкурентоспособной по сравнению с теми апликантами у которых рекомендательные письма "слабые" даже если балл по экзаменам одинаковый.
Постдок это временно!!!
Постдок официально звучит как Postdoctoral fellowship, у fellowship есть много переводов но в данном случае самое правильное это стипендия. Другими словами постдок это продолжение твоего обучения и за это обучение как хорошему "студенту" тебе платят стипендию, если ты где-то не добрал во время написания своего тезиса (независимо где именно "не добрал" в теоретических знаниях или в практике) вы делаете постдок чтобы восполнить этот пробел, для того чтобы потом стать профессором. И раньше, в штатах лет так 30-40 тому назад достаточно часто случалось что люди занимали профессорскую должность сразу после защиты, без никакого дополнительного тренинга. Сейчас же очень, очень редко когда люди которые сразу после окончания PhD получают профессорскую должность.
Поэтому это ошибочно когда люди воспринимают постдок как работу за которую платят зарплату, НЕТ это не работа и деньги которые вам платят не зарплата. Но почему же некоторые люди всё равно относятся к постдоку как к работе? Дело, в большей степени, из-за конкуренции, к сожалению или к счастью конкуренция очень высокая и она возрастает с каждым годом если не днём :). Из рисунка прекрасно видно, количество открытых позиций в академии (профессорские позиции) с годами особо не увеличиваются когда как количество PhDишников растёт с каждым годом, чуть ли не в "геометрической" прогрессии. Отсюда идёт естественное аккумулирование постдоков и продолжительность постодовского тренинга.
Image from: Nature Biotechnology31,938–941
Поэтому-то и работают постдоками по "10 лет", но конечно всё валить на конкуренцию не стоит многим из тех кто по "10 лет" сидит на постдоке может быть им так удобно, к примеру замужняя женщина с 3 детьми у которой муж - главный источник дохода, Она пришла-ушла, гранты писать не надо, никакие документации заполнять не надо, сидит ведёт свой проект никого не трогает, никто её не трогает, есть и такие.
Несколько видов постдоков: http://naukageek.blogspot.com/2014/05/9.html
На счёт рисунка паниковать тоже особо не надо, ведь академия (под словом академия я имею в виду любой университет или институт) это лишь один из видов продолжения вашей карьеры. В эти дни, биотехнологии и биоиндустрия это очень динамично развивающийся сектор экономики и там нужны люди со степенями, много из моих друзей и коллег перешли в так называемый "industry".
Ваш paycheck...
Наверное это у нас советское, хотим знать кто сколько зарабатывает :), а что тут такого? нормальное желание, людям интересно. Но в штатах особо не принято спрашивать сколько зарабатывает человек, но конечно с близкими друзьями и коллегами всё равно обсуждаешь эти вещи, я лично никогда не спрашиваю прямо "сколько ты зарабатываешь?" но когда к примеру один из моих знакомых перешёл в тот самый "industry" мне было просто интересно сколько там зарабатывают, я знал что больше чем в академии но не знал точно, он мне спокойно сказал что ему предложили 75К и он поднял до 80К в год. И тогда я подумал "да платят и впрямь больше :)".
Вот одна таблица, эта таблица из официального сайта NIH (National Institute of Health) и их рекомендуемая шкала "зарплат" в зависимости от опыта работы на 2014 год:
Table from grants.nih.gov
Так как NIH это главный источник финансирования практически всех исследовательских лаборатории в академии США то даже те стипендии которые финансируются из других организации и фондов всё равно равняются на NIH шкалу. Плюс ещё идёт небольшая поправка на штат в котором ты делаешь постдок, так как в каждом штате прожиточный минимум разный, отсюда стипендии могут варьироваться. Но в целом картина примерно такая как указано в таблице.
Я бы хотел обратить ваше внимание на слово "рекомендуемая", это не правило NIH, это не закон, это то как видит стипендии NIH, но не обязательно что ваш ментор будет видеть их также :). Некоторые могут конечно со мной поспорить но в реале именно так, но с другой стороны есть определённый нижний предел если платишь меньше этой линии то этот человек не может называться постдоком, он может называться technician, research assistant как угодно, но не постдок, если честно я не знаю этот нижний порог слышал про цифру 39К но в этом я не уверен, если найду впишу её обязательно.
Очень часто случается что постдокам платят меньше, только не подумайте что ваш ментор "жадина", это может быть обусловлено текущим состоянием финансов в вашей лаборатории, запомните когда профессор получает грант, там к примеру 250К в год то эти деньги на всё, на реагенты, мышей, клетки, и вашу "зарплату". Эти 250К он НЕ может положить себе в карман, они даются на исследования, как говориться "to run your lab" и не более того и они либо уйдут на исследования либо обратно в NIH. Так что чаще всего это обусловленно не очень хорошими финансами, а не какими-то личными качествами вашего ментора.
Так вот из этой цифры (что в таблице) вычтите налоги (федеральный и штата), MediCare и Social Security и ещё вашу медицинскую страховку и др. В итоге там останется....не знаю наверное кому как, но я думаю что все согласятся с тем что хватит чтобы прожить безбедно, но и пошиковать особо конечно не получиться, и опять всё зависит от штата, в каких-то штатах есть State Tax в каких-то нет (например Техас). Медицинская страховка зависит от института, в каких-то хороший пакет и дёшево, в каких-то не очень и относительно дорого.
И опять можно задать этот классический вопрос: " А почему так мало?". Всё очень просто, не забывайте что это не работа а тренинг. Маленький совет если не знали: Когда прибудете в штаты на постдок первое что сделаете это свяжитесь со своими отделом по "human resources" и спросите "Am I eligible for TAX TREATY?", все пост-советские страны впадают под когда-то подписанный ещё со времен СССР tax treaty где люди приезжающие в штаты из СССР а сейчас из СНГ не платят налоги в течении 2 лет. Если вы из стран СНГ то вы точно не должны платить федеральный налог, но налог штата зависит от штата, какие-то штаты follow федеральные правила в этом плане но какие-то нет, например Пенсильвания не follow эти правила, а значит если вы делаете постдок где нибудь в Питтсбурге то вы НЕ будете платить федеральный налог в течении первых 2 лет но будете платить налог штата. К таким "плохим" штатам ещё относятся Алабама, Арканзас, Калифорния, Коннектикут, Гавайи, Канзас, Кентуки, Мэриленд, Миссисипи, Монтана, Нью Джерси, Северная Дакота.
Ментор:
Ментор это грубо говоря ваш непосредственный начальник и работодатель. Здесь особо много писать не приходится, одно лишь могу сказать, постарайтесь найти такого ментора который будет заботиться о вашей карьере.
Каких менторов вы можете повстречать: http://naukageek.blogspot.com/2014/04/9_18.html
Обязаности:
Главная и основная обязанность постдока это делать исследования, кто-то делает эксперименты (benchwork), кто-то занимается статистическим анализом клинических данных, кто-то математическим моделированием, как говорится кто во что горазд.
Также у вас будут ещё и дополнительные обязанности которые не всегда напрямую связаны с вашими исследованиями. Так например, в лаборатории где я сейчас прохожу свой тренинг, в мои обязанности входит следить за одной колонией нокаут мышей. Мой проект не связан на прямую с этими мышами но тем не менее это входит в мои обязанности, и так со всеми постдоками в нашей лаборатории, кто-то следит за микроскопами, кто-то отвечает за покупку реагентов ну и всё в таком роде. В некоторых лабораториях есть должность lab manager, если так то вам повезло, этот человек будет отвечать за организацию лаборатории в которой вы трудитесь но наличие lab manager не означает автоматическое освобождение от дополнительной нагрузки.
На счёт написания манускриптов (научных статей) то это зависит от вашего ментора, кто-то не хочет "отвлекать" своего постдока от ежедневной работы, кто-то вовлекает своих постдоков в написание статей. Мой ментор не очень любит вовлекать нас в этот творческий процесс, так как ему легче написать всё самому нежели редактировать то что написал постдок, но я может быть первый кто возразил этому положению вещей и сказал что для меня это важный аспект в тренинге постдока. В итоге, он дал мне написать Methods и Figure Legends :). Заключение и перспективы:
Как говорил мой старый знакомый "I am not a dog, I am a postdoc!" Конечно на постдоке не легко, если вы хотите чтобы ваш тренинг был "временной" инстанцией то надо вкалывать, если и этим довольны то в целом можно сидеть спокойно и наслаждаться другими вещами.
Перспективы у всех разные в зависимости в какую лабораторию попали, кто ваш ментор, на сколько "горяча" та тема которой ты занимаешься и конечный успех зависит от многих факторов.
Ну и конечно какие цели вы ставите перед своим постдоком, многие ребята из стран Азии, просто хотят получить хороший тренинг, опубликоваться в хорошем журнале и вернуться на родину, кто-то ставит себе цель к примеру стать врачом в США и постдок для него лишь временное пристанище для решающего прыжка, каждый по своему видит свой постдок.
Как-то утром пью кофе и вспоминаю вчерашний нано-курс который назывался "Stem cells, Cancer and Heterogeneity", курс состоял из старбаковского американо в большом термосе и 4 лекций. Первые две были более менее понятны для меня, первая лекция о стволовых клетках, вторая лекция была о раковых клетках и о концепции стволовых раковых клеток. В целом, всё проходило достаточно размеренно. Но с 3-ей лекции, профессор Фернандо Комарго начал говорить не столько о стволовых раковых клетках сколько о гетерогенности раковых опухолей и lineage tracing. С этого всё и началось, если честно я мало что понял из его лекции так как где-то конечно краем уха я слышал такой термин как lineage tracing но в целом не знал что это такое.
Примерный перевод lineage tracing звучит как мониторинг за клеточной линией.
Задачи которые ставит перед собой lineage tracing достаточно простые это проследить как из одной клетки происходят другие а из них ещё и так по нарастающей до того момента пока эти клетки путём деления (пролиферации) и специализации (дифференциации) не превратятся в ткань. Или путём lineage tracing можно проследить какие клетки ответственны за тот или иной процесс в организме, например образование раковой опухоли, процессы заживления тканей и тд.
В одном из своих предыдущих сообщениях я делал общий обзор создания нокаут мышей ( ссылка: http://naukageek.blogspot.com/2014/06/tx-cre-lox-system.html) и там я коротко описал условный нокаут, так вот в основе современного in vivo lineage tracing лежит та же Cre-Lox система.
Один и тот же инструмент но используется под другим углом.
Если в случае с нокаут мышами всё достаточно "просто" где Cre рекомбиназа экспрессируется в определённых клетках в зависимости от промоутера или экспрессируется во временном аспекте например Cre рекомбиназу "сращивают" с эстрогеновым рецептором который специфичен для тамоксифена и при лечении тамоксифеном Cre рекомбиназа активизируется и может резать LoxP последовательности и убирать нужный вам ген.
В lineage tracing немного по другому, 1) вместо определённого гена прикрепляется последовательность которая кодирует флюоресцентный протеин например YFP (yellow fluorescent protein) а LoxP последовательности фланкируют СТОП последовательность (которая не даёт экспрессироваться YFP). 2) плазмида которая несёт Cre рекомбиназу более сложная, она несёт специфический промоутер (клеточная специфичность) и сама рекомбиназа экспрессируется в неактивной форме в виде тандема с эстрогеновым рецептором и только при тамоксифене Cre рекомбиназа обретает активную форму. Рисунок 1
Например, исследователи определили что стволовые клетки дермы экспрессируют Х ген, для того чтобы подтвердить что клетки экспрессирующие этот ген действительно играют первостепенную роль в обновлении кожного покрова. Промоутерная часть этого Х гена прикрепляется k Cre рекомбиназе эти мыши скрещиваются с мышами которые несут флюросцентный протеин с LoxP-СТОП-LoxP фланкированием. Отпрыски будут иметь два гена Cre и флюросцентный, и при лечении тамоксифеном рекомбиназа активизируется и режет СТОП последовательность, соответственно клетка начинает "светится" определённым цветом. Прекращаем лечение тамоксофеном и теперь те клетки которые "засветились" (клетки которые экспрессируют Х ген, которые по мнению исследователей являются стволовыми) будут делиться, дифференцироваться и этот флюросцентный ген будет переходить "по наследству" во все последующие клетки. И когда исследователи будут анализировать кожный покров мышей под конфокальным микроскопом то они по "светящимся" клеткам смогут определить насколько клетки несущие Х ген действительно влияют на обновление кожного покрова, его состав и т д.
Есть одна проблема, вернее их много но одна очень важная. это то что если мы к примеру пролечили тамоксифеном и определённый клетки засветились но мы хотим сделать этот lineage tracing не одну две недели а например несколько месяцев то тогда есть угроза слияния колоний соседних стволовых клеток. И если такое произойдёт то мы не сможем определить к какой именно клетке эта колония принадлежит.
И здесь исследователи ещё усложнили систему, они ввели мульти-флюросцентные кассеты (последовательности ДНК) так например на рисунке 2 показаны две кассеты которые кодируют 4 разных флюоресцентных, каждая кассета фланкированна LoxP последовательностями и при активизации Cre рекомбиназы она разрезает эти кассеты в результате мы можем иметь 4 возможных варианта с 4 разными цветами которые будут экспрессироваться в клетках что в итоге даёт возможность различать какой именно клон куда дифференцируется и пролиферирует (в данном контексте клон означать популяция клеток из одного предшественника).
Минусы:
Тамоксифен как известно это противораковый препарат, который при больших дозах теряет свою "раковую" специфичность. Поэтому лечение тамоксифеном не простая задача, но существуют ряд работ нацеленные на создание Cre плазмид которые очень чувствительны даже к малым дозам тамоксифена. Также сейчас существуют другие Cre рекомбиназы которые активизируются другими препаратами такие как доксициклин или тетрациклин как известно эти агенты менее токсичны.
Как уже упоминалось выше это потенциальное слияние двух разных колоний, но внедрение мульти-флюросцентных кассет решает эту проблему, также сейчас существуют плазмиды которые могут генерировать до 10 различных цветов и их оттенков так например модель Brainbow 1.0.
Некоторые флюросцентные протеины обладают токсичностью так например было обнаружено что RFP (red fluorescent protein) токсичен что приводит к смерти клеток, эта проблема была нивелированна путём открытия новых протеинов такие как TdTomato и mCherry которые визуализируются на похожей длинне световой волны как и RFP.
Плюсы:
Главный плюс современного lineage tracing который основан на генетической рекомбинации это то что интересующие вас клетки находяться в естественных условиях что подразумевает естественное их поведение во время гомеостаза и в стрессовых ситуациях. Так например, многие знания, наблюдения и свойства кроветворных стволовых клеток основаны на пересадке определённых популяций клеток костного мозга в животные у которых костный мозг был умерщвлён путём радиации, сами понимаете что этот метод достаточно грубый, и трансплантированные клетки находятся не в естественных условиях.
Интересующие вас клетки можно изолировать путём проточной цитометрии (flow cytometry) и уже с изолированными клетками вы можете делать "всё что хотите" можете экстрагировать ДНК, РНК или протеины, можете узнать что они экспрессируют а что нет, другими словами есть возможность для более полного и детального анализа.
Я считаю что это сообщение затрагивает лишь общие понятия и принципы современного lineage tracing если кто-то хочет знать больше то я бы рекомендовал этот вебсайт: http://www.stembook.org/node/542
Литература:
Nat Rev Cancer. 2013 Mar;13(3):161-71.
Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):33-45.
Nature. 2011 Jan 20;469(7330):314-22.
Cell 100, 157–168 (2000)
