Как-то утром пью кофе и вспоминаю вчерашний нано-курс который назывался "Stem cells, Cancer and Heterogeneity", курс состоял из старбаковского американо в большом термосе и 4 лекций. Первые две были более менее понятны для меня, первая лекция о стволовых клетках, вторая лекция была о раковых клетках и о концепции стволовых раковых клеток. В целом, всё проходило достаточно размеренно. Но с 3-ей лекции, профессор Фернандо Комарго начал говорить не столько о стволовых раковых клетках сколько о гетерогенности раковых опухолей и lineage tracing. С этого всё и началось, если честно я мало что понял из его лекции так как где-то конечно краем уха я слышал такой термин как lineage tracing но в целом не знал что это такое.
Примерный перевод lineage tracing звучит как мониторинг за клеточной линией.
Задачи которые ставит перед собой lineage tracing достаточно простые это проследить как из одной клетки происходят другие а из них ещё и так по нарастающей до того момента пока эти клетки путём деления (пролиферации) и специализации (дифференциации) не превратятся в ткань. Или путём lineage tracing можно проследить какие клетки ответственны за тот или иной процесс в организме, например образование раковой опухоли, процессы заживления тканей и тд.
В одном из своих предыдущих сообщениях я делал общий обзор создания нокаут мышей ( ссылка: http://naukageek.blogspot.com/2014/06/tx-cre-lox-system.html) и там я коротко описал условный нокаут, так вот в основе современного in vivo lineage tracing лежит та же Cre-Lox система.
Один и тот же инструмент но используется под другим углом.
Если в случае с нокаут мышами всё достаточно "просто" где Cre рекомбиназа экспрессируется в определённых клетках в зависимости от промоутера или экспрессируется во временном аспекте например Cre рекомбиназу "сращивают" с эстрогеновым рецептором который специфичен для тамоксифена и при лечении тамоксифеном Cre рекомбиназа активизируется и может резать LoxP последовательности и убирать нужный вам ген.
В lineage tracing немного по другому, 1) вместо определённого гена прикрепляется последовательность которая кодирует флюоресцентный протеин например YFP (yellow fluorescent protein) а LoxP последовательности фланкируют СТОП последовательность (которая не даёт экспрессироваться YFP). 2) плазмида которая несёт Cre рекомбиназу более сложная, она несёт специфический промоутер (клеточная специфичность) и сама рекомбиназа экспрессируется в неактивной форме в виде тандема с эстрогеновым рецептором и только при тамоксифене Cre рекомбиназа обретает активную форму. Рисунок 1
Например, исследователи определили что стволовые клетки дермы экспрессируют Х ген, для того чтобы подтвердить что клетки экспрессирующие этот ген действительно играют первостепенную роль в обновлении кожного покрова. Промоутерная часть этого Х гена прикрепляется k Cre рекомбиназе эти мыши скрещиваются с мышами которые несут флюросцентный протеин с LoxP-СТОП-LoxP фланкированием. Отпрыски будут иметь два гена Cre и флюросцентный, и при лечении тамоксифеном рекомбиназа активизируется и режет СТОП последовательность, соответственно клетка начинает "светится" определённым цветом. Прекращаем лечение тамоксофеном и теперь те клетки которые "засветились" (клетки которые экспрессируют Х ген, которые по мнению исследователей являются стволовыми) будут делиться, дифференцироваться и этот флюросцентный ген будет переходить "по наследству" во все последующие клетки. И когда исследователи будут анализировать кожный покров мышей под конфокальным микроскопом то они по "светящимся" клеткам смогут определить насколько клетки несущие Х ген действительно влияют на обновление кожного покрова, его состав и т д.
Есть одна проблема, вернее их много но одна очень важная. это то что если мы к примеру пролечили тамоксифеном и определённый клетки засветились но мы хотим сделать этот lineage tracing не одну две недели а например несколько месяцев то тогда есть угроза слияния колоний соседних стволовых клеток. И если такое произойдёт то мы не сможем определить к какой именно клетке эта колония принадлежит.
И здесь исследователи ещё усложнили систему, они ввели мульти-флюросцентные кассеты (последовательности ДНК) так например на рисунке 2 показаны две кассеты которые кодируют 4 разных флюоресцентных, каждая кассета фланкированна LoxP последовательностями и при активизации Cre рекомбиназы она разрезает эти кассеты в результате мы можем иметь 4 возможных варианта с 4 разными цветами которые будут экспрессироваться в клетках что в итоге даёт возможность различать какой именно клон куда дифференцируется и пролиферирует (в данном контексте клон означать популяция клеток из одного предшественника).
Минусы:
Тамоксифен как известно это противораковый препарат, который при больших дозах теряет свою "раковую" специфичность. Поэтому лечение тамоксифеном не простая задача, но существуют ряд работ нацеленные на создание Cre плазмид которые очень чувствительны даже к малым дозам тамоксифена. Также сейчас существуют другие Cre рекомбиназы которые активизируются другими препаратами такие как доксициклин или тетрациклин как известно эти агенты менее токсичны.
Как уже упоминалось выше это потенциальное слияние двух разных колоний, но внедрение мульти-флюросцентных кассет решает эту проблему, также сейчас существуют плазмиды которые могут генерировать до 10 различных цветов и их оттенков так например модель Brainbow 1.0.
Некоторые флюросцентные протеины обладают токсичностью так например было обнаружено что RFP (red fluorescent protein) токсичен что приводит к смерти клеток, эта проблема была нивелированна путём открытия новых протеинов такие как TdTomato и mCherry которые визуализируются на похожей длинне световой волны как и RFP.
Плюсы:
Главный плюс современного lineage tracing который основан на генетической рекомбинации это то что интересующие вас клетки находяться в естественных условиях что подразумевает естественное их поведение во время гомеостаза и в стрессовых ситуациях. Так например, многие знания, наблюдения и свойства кроветворных стволовых клеток основаны на пересадке определённых популяций клеток костного мозга в животные у которых костный мозг был умерщвлён путём радиации, сами понимаете что этот метод достаточно грубый, и трансплантированные клетки находятся не в естественных условиях.
Интересующие вас клетки можно изолировать путём проточной цитометрии (flow cytometry) и уже с изолированными клетками вы можете делать "всё что хотите" можете экстрагировать ДНК, РНК или протеины, можете узнать что они экспрессируют а что нет, другими словами есть возможность для более полного и детального анализа.
Я считаю что это сообщение затрагивает лишь общие понятия и принципы современного lineage tracing если кто-то хочет знать больше то я бы рекомендовал этот вебсайт: http://www.stembook.org/node/542
Литература:
Nat Rev Cancer. 2013 Mar;13(3):161-71.
Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):33-45.
Nature. 2011 Jan 20;469(7330):314-22.
Cell 100, 157–168 (2000)
Примерный перевод lineage tracing звучит как мониторинг за клеточной линией.
Задачи которые ставит перед собой lineage tracing достаточно простые это проследить как из одной клетки происходят другие а из них ещё и так по нарастающей до того момента пока эти клетки путём деления (пролиферации) и специализации (дифференциации) не превратятся в ткань. Или путём lineage tracing можно проследить какие клетки ответственны за тот или иной процесс в организме, например образование раковой опухоли, процессы заживления тканей и тд.
В одном из своих предыдущих сообщениях я делал общий обзор создания нокаут мышей ( ссылка: http://naukageek.blogspot.com/2014/06/tx-cre-lox-system.html) и там я коротко описал условный нокаут, так вот в основе современного in vivo lineage tracing лежит та же Cre-Lox система.
Один и тот же инструмент но используется под другим углом.
Если в случае с нокаут мышами всё достаточно "просто" где Cre рекомбиназа экспрессируется в определённых клетках в зависимости от промоутера или экспрессируется во временном аспекте например Cre рекомбиназу "сращивают" с эстрогеновым рецептором который специфичен для тамоксифена и при лечении тамоксифеном Cre рекомбиназа активизируется и может резать LoxP последовательности и убирать нужный вам ген.
В lineage tracing немного по другому, 1) вместо определённого гена прикрепляется последовательность которая кодирует флюоресцентный протеин например YFP (yellow fluorescent protein) а LoxP последовательности фланкируют СТОП последовательность (которая не даёт экспрессироваться YFP). 2) плазмида которая несёт Cre рекомбиназу более сложная, она несёт специфический промоутер (клеточная специфичность) и сама рекомбиназа экспрессируется в неактивной форме в виде тандема с эстрогеновым рецептором и только при тамоксифене Cre рекомбиназа обретает активную форму. Рисунок 1
Например, исследователи определили что стволовые клетки дермы экспрессируют Х ген, для того чтобы подтвердить что клетки экспрессирующие этот ген действительно играют первостепенную роль в обновлении кожного покрова. Промоутерная часть этого Х гена прикрепляется k Cre рекомбиназе эти мыши скрещиваются с мышами которые несут флюросцентный протеин с LoxP-СТОП-LoxP фланкированием. Отпрыски будут иметь два гена Cre и флюросцентный, и при лечении тамоксифеном рекомбиназа активизируется и режет СТОП последовательность, соответственно клетка начинает "светится" определённым цветом. Прекращаем лечение тамоксофеном и теперь те клетки которые "засветились" (клетки которые экспрессируют Х ген, которые по мнению исследователей являются стволовыми) будут делиться, дифференцироваться и этот флюросцентный ген будет переходить "по наследству" во все последующие клетки. И когда исследователи будут анализировать кожный покров мышей под конфокальным микроскопом то они по "светящимся" клеткам смогут определить насколько клетки несущие Х ген действительно влияют на обновление кожного покрова, его состав и т д.
Есть одна проблема, вернее их много но одна очень важная. это то что если мы к примеру пролечили тамоксифеном и определённый клетки засветились но мы хотим сделать этот lineage tracing не одну две недели а например несколько месяцев то тогда есть угроза слияния колоний соседних стволовых клеток. И если такое произойдёт то мы не сможем определить к какой именно клетке эта колония принадлежит.
И здесь исследователи ещё усложнили систему, они ввели мульти-флюросцентные кассеты (последовательности ДНК) так например на рисунке 2 показаны две кассеты которые кодируют 4 разных флюоресцентных, каждая кассета фланкированна LoxP последовательностями и при активизации Cre рекомбиназы она разрезает эти кассеты в результате мы можем иметь 4 возможных варианта с 4 разными цветами которые будут экспрессироваться в клетках что в итоге даёт возможность различать какой именно клон куда дифференцируется и пролиферирует (в данном контексте клон означать популяция клеток из одного предшественника).
Тамоксифен как известно это противораковый препарат, который при больших дозах теряет свою "раковую" специфичность. Поэтому лечение тамоксифеном не простая задача, но существуют ряд работ нацеленные на создание Cre плазмид которые очень чувствительны даже к малым дозам тамоксифена. Также сейчас существуют другие Cre рекомбиназы которые активизируются другими препаратами такие как доксициклин или тетрациклин как известно эти агенты менее токсичны.
Как уже упоминалось выше это потенциальное слияние двух разных колоний, но внедрение мульти-флюросцентных кассет решает эту проблему, также сейчас существуют плазмиды которые могут генерировать до 10 различных цветов и их оттенков так например модель Brainbow 1.0.
Некоторые флюросцентные протеины обладают токсичностью так например было обнаружено что RFP (red fluorescent protein) токсичен что приводит к смерти клеток, эта проблема была нивелированна путём открытия новых протеинов такие как TdTomato и mCherry которые визуализируются на похожей длинне световой волны как и RFP.
Плюсы:
Главный плюс современного lineage tracing который основан на генетической рекомбинации это то что интересующие вас клетки находяться в естественных условиях что подразумевает естественное их поведение во время гомеостаза и в стрессовых ситуациях. Так например, многие знания, наблюдения и свойства кроветворных стволовых клеток основаны на пересадке определённых популяций клеток костного мозга в животные у которых костный мозг был умерщвлён путём радиации, сами понимаете что этот метод достаточно грубый, и трансплантированные клетки находятся не в естественных условиях.
Интересующие вас клетки можно изолировать путём проточной цитометрии (flow cytometry) и уже с изолированными клетками вы можете делать "всё что хотите" можете экстрагировать ДНК, РНК или протеины, можете узнать что они экспрессируют а что нет, другими словами есть возможность для более полного и детального анализа.
Я считаю что это сообщение затрагивает лишь общие понятия и принципы современного lineage tracing если кто-то хочет знать больше то я бы рекомендовал этот вебсайт: http://www.stembook.org/node/542
Литература:
Nat Rev Cancer. 2013 Mar;13(3):161-71.
Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):33-45.
Nature. 2011 Jan 20;469(7330):314-22.
Cell 100, 157–168 (2000)
Комментариев нет:
Отправить комментарий