CRISPR/Cas9 как полёт в космос

Не так давно шли дискуссии о том нужно ли вводить "hawk eye" систему в наш РФПЛ (хоук ай это камера которая находится высоко над футбольным полем и двигается вперёд и назад по стальному тросу, тем самым можно делать вид сверху и наблюдать передвижение всей команды по полю а также очень полезная вещь в спорных ситуациях в помощь арбитрам, например пересёк мяч линию ворот или нет). И во время этой дискуссии один журналист спросил Станислава Черчесова (нынешний тренер московского Динамо): - Как вы относитесь к введению хоук ай ?
- Хоук Ай для Российской Премьер Лиги как полёт в космос.

Почему-то когда слушал лекцию Дэвида Вайсса из Emory University вспомнил именно это высказывание. И действительно я только, только разобрался с Cre-loxP системой а тут на тебе CRISPR/Cas9 ситема которая и удобнее и эффективнее (http://naukageek.blogspot.com/2014/06/tx-cre-lox-system.html). Как сказал один воротила силиконовой долины: Когда ты покупаешь компьютер, ты покупаешь вчерашний день.

CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) это участок ДНК который найден во многих бактериях. CRISPR также называют "иммунитетом" бактерий. Дело в том что CRISPR в ассоциацией с нуклеазами такие как Cas9 могут защитить бактерию от вредных ему вирусов путём разрушения чужеродного ДНК.

В итоге получилась достаточно эффективная штука, которую можно использовать по разному как говорится кто на что горазд, CRISPR/Cas9 система может служить как терапевтический инструмент в лечении генетических заболеваний, скрининга целевых генов в развитии лекарств для лечения болезней которые сейчас не лечатся, ну и само собой CRISPR/Cas9 уже сейчас достаточно активно утилизируется в генной инженерии (например в выведение нокаут мышей, linage tracing мышей, conditional knockout мышей и кстати других млекопитающих такие как крысы, вы не задавались вопросом почему столько нокаут мышей и очень редко кто работает или выводит нокаут крыс? Ответ на поверхности что легче то и выводят).

Как же это работает:
Давайте сначала посмотрим как CRISPR/Cas9 система работает в природе. Для того чтобы этот механизм работал без сбоев, требуются три компонента Cas9, crRNA и tracrRNA.
Cas9 как уже упоминалось это нуклеаза которая собственно и будет резать чужеродный ДНК, но вопрос а почему Cas9,  а не -8 или -5? Да существуют и другие нуклеазы, но в биотехнологии используется в основном CRISPR механизм 2-го типа и в нём участвует только Cas9, 2-ой тип это наиболее изученный и наиболее оптимальный, и достаточно простой механизм.
crRNA (CRISPR-RNA) это собственно тот самый РНК (20 нуклеотидов) который комплементарен чужеродному ДНК и будет связываться образую комплекс ДНК-РНК.
tracrRNA (Trans-activating crRNA) это тоже маленький участок РНК который необходим для созревания crRNA.
В итоге crRNA связывается, к примеру, с вирусным ДНК и этот комплекс распознаётся нуклеазой Cas9 и нуклеаза режет две нити вирусного ДНК рисунок ниже.

Image from NEB.com

В лаборатории CRISPR/Cas9 система  примерно также, только немного упрощена и нацелена на родной, клеточный ДНК. Первое что предприняли молекулярные биологи это срастили crRNA и tracrRNA и назвали этого гибрида как sgRNA (single guide RNA). И сейчас можно делать трансфекцию лишь одной плазмиды на которой уже будет ваш sgRNA и Cas9 и тем самым убирать любой участок ДНК в геноме клетки (как говориться производить нокаут) рисунок ниже.

Image from IDT.com

Cas9 будет резать нужный вам геномный участок ДНК и это индуцирует механизм который называется Non-Homologous End Joining (NHEJ), в результате этого процесса небольшой участок ДНК где произошло разрезание будет отсутствовать (для лучшего понимания NHEJ советую посмотреть это видео https://www.youtube.com/watch?v=31stiofJjYw ). Также можно внедрить условно говоря любую ДНК последовательность, но для этого помимо всего то что было сказано выше нам понадобится трансфектировать ещё одну плазмиду, которая будет нести собственно ваш ДНК концы которого будут комплементарны концам разрезанного участка ДНК. При этом репарация ДНК пойдёт другим путём так называемым гомологичным сращиванием концов (homology directed repair, HDR https://www.youtube.com/watch?v=86JCMM5kb2A). Внедряют обычно последовательность которая будет либо понижат экспрессию вашего гена (внедрение stop sequence) или увеличивать (activation sequence) рисунок ниже.
Ещё одна особенность этой системы это то что на 3' конце противоположной нити ДНК должна находиться PAM (Protospacer adjacent motif) последовательность, Например для Cas9 из Streptococcus pyogenes PAM это NGG (N-любой нуклеотид). Без этой последовательности процесс невозможен. В помощь исследователям есть множество программ которые смогут найти для вас оптимальную последовательность содержащую PAM.

Image from NEB.com

В целом можно сказать CRISPR/Cas9 система очень полезна для биологов, достаточно быстро можно "нокаутировать" мышей, например если брать механизм гомологичной рекомбинации то исследователи могут затратить в среднем 1-1.5 года на выведение одной линии нокаут мышей, когда как с использованием CRISPR/Cas9 это время сокращается до 6-7 месяцев.
Конечно также есть и свои трудности. Например существует вероятность off-target мутаций. Чтобы исправить этот недостаток существует метод введения двух sgRNA которые нацеливаются на один ген, тем самым вероятность ошибки падает значительно. Плюс можно и нужно проводить скрининг и тем самым избавляться от off-target мутаций (хотя скрининг достаточно трудоёмкое занятие).

Image from NEB.com

Литература:
Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23.
Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63.

Science. 2014 Nov 28;346(6213)

Интерлейкин-3 наше всё?

Ходим ли мы по кругу или всё таки делаем какой-то прогресс?
Все то что мы нашли будет ли полезно или всё таки это так и останется на бумаге? Какова значимость тех или иных открытий, опубликование в Science или Nature это знак качества?
Или может я как исследовательская единица смотрю на все происходящее со "своей колокольни"? Если честно я не верю в то что внедрение одного цитокина или его нейтрализация может излечить человека от сепсиса, я перестал в это верить когда все антитела которые были нацелены на обезвреживание цитокинов провалились в клинических испытаниях, понимаете ни один, ни два а все. (http://naukageek.blogspot.com/2014/11/blog-post_13.html)
Но может быть я не прав? Может быть просто нацеливались не на те цитокины, не так подобрали антитела, а может ещё что: неправильное дозирование, время лечения?

Так вот 13 марта этого года вышла статья где говориться об интерлейкине-3 (ИЛ-3) как потенциальная цель в лечении сепсиса.

Я хотел бы для начала поговорить о профессоре в лаборатории которого сие открытие сделано.
Филип Свирски, на мой взгляд очень талантливый учёный, достаточно молодой (на мой взгляд может немного за 40), знаете такой высокий мужчина, статный, в очках и с таким очаровательным британским акцентом,работает он в MGH (Massachusetts General Hospital) это относительно недалеко от того места где я работаю.  Так что он часто даёт лекции в нашем госпитале, тем более ему есть что сказать. Когда я впервые послушал его лекцию, меня как-будто обдул свежий ветер, ветер нового поколения исследователей, мотивированных, собранных, точно знающих то что они хотят и результаты его были очень интересные.
Изначально док Свирски не занимался сепсисом, он достаточно успешно трудился в области атеросклероза и других кардиоваскулярных заболеваний. Изучал он влияние иммунной системы, а в частности влияние различных типов моноцитов в развитие атеросклероза. Большое внимание он уделял селезёнке, утверждая что это чуть ли не краеугольный камень в формировании атеромы. Хотя очень старое эпидемиологическое исследование (исследовали солдат второй мировой войны которые подверглись спленоктомии, и документировали какова частота заболевания кардиоваскулярными болезнями, в итоге оказалось что ветераны со спленоктомией были более подвержены сердечно сосудистым заболеваниям) шло вразрез его современным исследованиям.

И вот в 2012 году он публикует, не то чтобы интересную, но в определённой степени инновационную работу где характеризует новый тип В-лимфоцитов и называет их как Innate Response Activator B cells (журнал Science). В этой работе его лаборатория утверждает что эти клетки нужны для защиты организма от патогенных микробов, эти IRA B клетки имеют уникальную способность продуцировать GM-CSF (granulocyte monocyte - colony stimulating factor) который в свою очередь показал потенциальную терапевтическую принадлежность в лечении сепсиса. Самые наверное "striking" результаты были когда они вывели IRA B cell дефицитные животных и наравне с нормальными мышами подвергли их сепсису, 40% выживших наблюдалось в контроле когда как в дефицитных мышах 0%, все мыши погибли в течении 2 дней. Те кто хоть раз пробовал сделать эту модель экспериментального сепсиса, я думаю оценят это действительно яркий фенотип говорящий о важности этой популяции клеток.

Через 3 года, то бишь в 2015, лаборатория Свирски публикует ещё одну работу о сепсисе (наверное R01 получил :) ), и в этой работе он исследует один цитокин ИЛ-3. ИЛ-3 это плейотропный протеин который участвует в пролиферации и дифференциации различных клеток костного мозга, миелоидных и лимфоидных популяции. Они также идентифицировали что ИЛ-3 это ведущая сила в мобилизации про-воспалительной реакции иммунной системы которая ведёт к нарушению функции органов и соответственно к смерти. И логически если блокировать ИЛ-3 то воспалительная реакция более слабая, меньше циркулирующих моноцитов и нейтрофилов, меньше негативного влияния на органы жизнедеятельности что в итоге приводит к выживанию. В добавок, в подтверждение своих экспериментов, группа Свирски нашла корреляцию между концентрации ИЛ-3 в крови септических пациентов, чем выше тем прогноз хуже.

Данные конечно интересные и заслуживают внимания, но почему-то прочитав эту статью я не мог отделаться от мысли что эта история очень похожа на историю с TNF-a и все мы прекрасно знаем чем всё это в итоге закончилось.  

Жизнь, смерть и обратно.

Теоретическая физика утверждает что есть возможность летать во времени, но нет устройства который бы был способен на это. Раз сел в эту машину времени, и улетел на 20 лет назад, захотел и на 30 лет вперёд, вот весело будем  жить. Но нет такой машины, много что есть, господа учёные много что смастерили и атомную бомбу, и в космос летаем как на Таити олигархи. Много что такого мы изобрели, и биологи тоже многим могут похвастаться, биологи тоже сложа руки не сидели, тоже работали днями и ночами и результаты у них тоже впечатляющие.
Но есть вещи которые неоспоримы такие как жизнь и смерть. Даже философы (какие уж там биологи) считают что жизнь не отделима от смерти, что жизнь это своего рода смерть и наоборот. А ещё считают что жизнь любого живого существа это билет в один конец, родился значит когда нибудь умрёт другого пути нет. А почему так считают? Так потому что никто ещё не вырывался из лап смерти попав туда, вот поэтому и суждение такое.

Биологи всем этим суждениям не противоречат, кто-то скажет что жизнь это билет в один конец, биологи лишь кивают мол да согласны. А в лабораториях своих эксперименты делают свои мысли при себе держат лишь только лабораторный персонал знает что к чему и всё на этом. Биологи же не философы, они свои работы не на своих мыслях строят, а на результатах экспериментов и наблюдений.
И ещё одна черта, не берутся господа биологи сразу за такой большой вопрос о жизни и смерти как философы, поступательно биологи действуют кирпичик за кирпичиком, болтик за болтиком, и иногда жизни не хватает чтобы полную картину создать того  что задумал, но и здесь нашли они выход, тренируют биологи учёные себе подобных, мыслями своими своих учеников заражают, как грипп воздушно-капельным путём, чтобы после их смерти продолжили ученики дело учителя. Работает система, хорошо работает.

Так и смерть разобрали на составляющие, и сейчас запрограммированная клеточная смерть апоптозом называется. Процесс апоптоз условно можно поделить на четыре фазы: инициация, усиление, исполнение и смерть. И догма молекулярной биологии заключается в том что если клетка входит в фазу исполнения то обратного пути нет.
Самыми важными молекулами в этом процессе считаются каспазы (протеины исполнители), пик активности каспаз приходит соответственно на фазу исполнения. Каспазы участвуют во фрагментации ДНК и в разрушении протеинов которые жизненно необходимы для клетки. Догма апоптоза заключается в том что с активизацией каспаз процесс становится необратимым.

Но есть такой учёный Дениз Монтел (Denise Montell) которая взяла и подставила под сомнение эту догму. Дело в том что точка невозврата у всех разная, у каждого типа клеток он свой, также многое зависит от индуктора апоптоза, его концентрации и продолжительности инкубации. Док. Монтелл и её коллеги из Калифорнийского Университета в Санта Барбара задались простыми вопросами а где эта последняя черта невозврата? Является ли активизация каспаз тем самым водоразделом между жизнью и смертью клетки?

Чтобы ответить на эти вопросы, они индуцировали апоптоз и инкубировали до того момента пока не появятся явные морфологические и молекулярные признаки смерти клетки такие как уменьшение размеров клетки, фрагментация ДНК и активизация каспаз. После этого клетки были промыты физиологическим раствором и инкубировались без индуктора апоптоза. Парадоксально, но клетки вместо того чтобы умереть, восстановились после стресса и продолжали дальше расти (видео обратимости апоптоза: https://www.youtube.com/watch?v=CkHC6BlrbAM ).

Исследователи проверили этот эффект на разных клеточных линиях включая свеже-изолированные клетки такие как фибробласты, гепатоциты, раковые клетки и макрофаги. Соответственно, индуцировали апоптоз различными агентами фибробласты диметилсульфоксидом, гепатоциты этанолом и т.д. И несмотря на разные клеточные культуры и различные индукторы эффект обратимости исполнительной фазы апоптоза был задокументирован во всех случаях, говоря об универсальности механизма восстановления клетки как и универсальность апоптоза. Процесс обратимости запрограммированной смерти клетки был назван анастаз "anastasis" (что с греческого переводится как "возрождение", "подъём") в противовес апоптозу (что с греческого означает "падение"). В этой работе исследователи также анализировали ДНК "анастазированных" клеток найдя в них различные хромосомные аномалии которые часто встречаются в раковых клетках.

Насколько мне известно работа док. Монтелл которую я описал является пока единственной в этой области. Дальнейшие исследования этого процесса имеют хорошую перспективу в изучении онкологических новообразований. Является ли анастаз эволюционным механизмом адаптации раковых клеток к химио- или радиотерапии? Ведь как известно если рак "возвращается" после курса терапии то болезнь обретает более агрессивный характер с большей толерантностью к препаратам. Какова роль анастаза в нейродегенеративных расстройствах, в сердечно сосудистых заболеваниях? Все эти вопросы пока открыты.

Литература:
Mol Biol Cell. 2012;23(12):2240-52